致病性大腸埃希氏菌的生物學(xué)特性與檢驗(yàn)方法！

致病性大腸埃希氏菌是指能使人,、動(dòng)物(尤其是嬰兒和幼齡動(dòng)物)感染及人食物中毒的一群大腸桿菌,。

在自然界中本菌分布廣泛，主要寄居場(chǎng)所是人和其它溫血?jiǎng)游锏哪c道中,，是一類(lèi)條件性致病菌,。致病性大腸埃希氏菌的形態(tài)特點(diǎn),、培養(yǎng)特性和生化特性均與非致病性大腸埃希氏菌非常相似，以至難以區(qū)分,，只能通過(guò)血清學(xué)的方法,，從抗原結(jié)構(gòu)的差異來(lái)區(qū)別。在致病性大腸埃希氏菌中,，有些血清型能夠引起人的食物中毒,，有些血清型能夠引起人的腸道內(nèi)外感染。還有一些血清型的菌株能夠使畜禽發(fā)病,，危害畜牧業(yè),，降低畜產(chǎn)食品的質(zhì)量。致病性大腸埃希氏菌可從飲用水,，未消毒牛乳,，病畜臟器、禽類(lèi)及其人畜糞便污染的各種食品中分離出來(lái),。

致病性大腸埃希氏菌屬主要分為五大類(lèi),，首先根據(jù)發(fā)病機(jī)理分為三大類(lèi)，

1,、產(chǎn)毒素型大腸埃希氏菌(ETEC),，

2、侵襲型大腸埃希氏菌(EIEC)

3,、腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)

近來(lái)又提出另外兩類(lèi)

4,、即出血性大腸埃希氏菌(EHEC)

5、腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)

但是,，致病性大腸埃希氏菌的致病性是一個(gè)很復(fù)雜的問(wèn)題,，也并非由某一方面的因素所決定。

致病性大腸埃希氏菌中,，一般認(rèn)為能產(chǎn)生耐熱{ST)和不耐熱(LT)腸毒素的兩種菌株均可引起人的食物中毒,。引起大腸埃希氏菌幣毒的主要是一些動(dòng)物性食品，如乳與乳制品,、肉類(lèi),、水產(chǎn)品等，牛和豬是傳播這種病菌,、引起中毒的主要原因,。

1996年7月在日本就發(fā)生了大腸桿菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒,，10人死亡,，其原因與生食蘿卜苗有關(guān)，其中92例并發(fā)出血性腸炎及出血性尿毒癥,。2001年,，再江蘇、安徽等地爆發(fā)的腸出血性大腸桿菌0157:H7食物中毒,，造成177人死亡,，中毒人數(shù)超過(guò)2萬(wàn)人。

如仔豬黃,、白痢,、豬水腫病、牛腹瀉和敗血癥等均可由大腸桿菌引起,。

一,、生物學(xué)特性

1、形態(tài)與染色特性

菌體兩端鈍圓,、中等大小,，桿狀(有時(shí)呈卵圓形)、1—3um X 0.6um,、周生鞭毛,，能運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)生莢膜,，革蘭氏陰性,，而且一般是對(duì)堿性染料著色較好，但有時(shí)兩端著色較濃,，要與巴氏桿菌區(qū)分開(kāi)來(lái),。

2、培養(yǎng)特性

1）需氧及兼性厭氧菌

2）對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高,，在普通瓊脂上就生長(zhǎng)良好,，在15C-45℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)溫度為37℃,，pH為7.2—7.4,。

3）在普通瓊脂平板上培養(yǎng)24小時(shí)，可形成圓形,、凸起,、光滑、濕潤(rùn),、半透明,、邊緣整齊、中等大小的菌落．其菌落與沙門(mén)氏菌比較相似,，但是,，大腸桿菌菌落對(duì)光(45角折射)觀察可見(jiàn)熒光。

4）在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)18～24小時(shí)變?yōu)榫鶆驕?，而后底部出現(xiàn)粘性沉淀物,，并伴有臭味,。

5）部分菌落可出現(xiàn)β溶血。

6）在遠(yuǎn)藤瓊脂上長(zhǎng)成帶金屬光澤的紅色菌落

7）在S．S瓊脂平板上多不生長(zhǎng),，少數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)菌,，也因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而形成紅色菌落；

8）在伊紅美蘭瓊脂上形成具有金屬光澤的黑色菌落

9）在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)后孤立菌落呈紅色

3,、生化特性

1）可發(fā)酵葡萄糖,、乳糖、麥芽糖,、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣,，有些不典型的菌株不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖；

2）不同菌株對(duì)蔗糖,，衛(wèi)矛醇,、水楊苷發(fā)酵結(jié)果不一致。

3）本菌可使賴(lài)氨酸脫鞍,、不能使苯丙氨酸脫羧,。

4）不產(chǎn)生H2S，不液化明膠,，不分解尿素,，

5）不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性,，V-P試驗(yàn)陰性,，不利用枸櫞酸鹽。后四項(xiàng)生化特性是典型的大腸埃希氏菌,，與此不一致的即為非典型大腸埃希氏菌菌,。

IMViC試驗(yàn)：如IMViC試驗(yàn)為+、+,、-,、-，且乳糖發(fā)酵,，表明被檢物已有糞便污染,，有發(fā)生腸道傳染病的危險(xiǎn)，這是衛(wèi)生細(xì)菌中常用的檢測(cè)指標(biāo),。（I：吲哚形成試驗(yàn),，M：甲基紅試驗(yàn)，Vi：V-P試驗(yàn),，C：枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)）

4,、血清學(xué)特性

大腸埃希氏菌的抗原構(gòu)造主要由菌體抗原(O)，鞭毛抗原(H)和莢膜抗原(K)三部分組成。

1）O抗原

成分為細(xì)胞壁上的糖,、類(lèi)脂和蛋白質(zhì)復(fù)合物,，也是細(xì)菌的內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定性較強(qiáng),，高壓蒸汽處理2小時(shí)不被破壞,。每一血清型只含有一種O抗原,，本菌已發(fā)現(xiàn)有167種O抗原,，分別以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。

2）H抗原

為蛋白質(zhì),；一種大腸埃希氏菌只有一種H抗原,，無(wú)鞭毛則無(wú)H抗原，H抗原能在80度被破壞,，也能被酒精破壞,。H抗原共有64種。

3）K抗原

是細(xì)胞外部的莢膜或的表面物質(zhì),，又稱(chēng)包膜抗原,。新分離的大腸埃希氏菌70％具有K抗原。根據(jù)K抗原耐熱的敏感性．可把K抗原分為A,、B,、L三類(lèi)，共有103種,，致病性大腸埃希氏菌的抗原主要為B抗原,，少數(shù)為L(zhǎng)抗原，B抗原與L抗原均可在煮沸后被破壞,，A抗原耐熱性強(qiáng),，可耐受煮沸1小時(shí)而不被破壞。,，

O抗原可將大腸埃希氏菌分成若干血清群,，再根據(jù)K抗原和H抗原進(jìn)一步分為若干個(gè)血清型或亞型，根據(jù)大腸埃希氏菌抗原的鑒定結(jié)果,，寫(xiě)出其抗原式如O111：K58(B)H12,，一般認(rèn)為H抗原與致病性無(wú)關(guān)，因此,，一般不需要進(jìn)行H抗原的鑒定,。

5、抵抗力

抵抗力中等,，各菌型之間存在差異,。此菌對(duì)青霉素有中等抵抗力，對(duì)一般消毒劑都比較敏感。對(duì)氯尤為敏感,，水中游離氯達(dá)到0．2mg／L時(shí),，即可殺死此菌。此菌在土壤中,、水中及糞便中可存活數(shù)月以上,。

6、毒素特性

有些大腸埃希氏菌產(chǎn)生腸毒素,，

1）不耐熱(LT)腸毒素（heat-labile enterotoxin,，LT）：化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，分子量較大,，60℃ 30分破壞,，具有免疫原性，可引起腸道分泌增加,，出現(xiàn)腹瀉,。

2）耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量較小,，無(wú)抗原性,，100℃ 30分鐘，仍有活性,，可引起腸分泌增加,。

二、致病性

致病性大腸埃希氏菌屬引起酌食物中毒主要有兩種類(lèi)型,，一種是腸道內(nèi)感染,，另一種是腸道外感染，兩者具有不同的機(jī)理和癥狀：

1,、腸道內(nèi)感染

1）腸毒素型大腸桿菌（ETEC）：主要引起腹瀉（幼畜或雛雞）,，約有40個(gè)血清型。腸毒素型菌株進(jìn)入腸道后主要在小腸內(nèi)繁殖,，不損害腸上皮細(xì)胞,。繁殖過(guò)程中產(chǎn)生腸毒素。

2）腸致病型大腸桿菌（EPEC）：是引起嬰兒腹瀉的主要病原菌,，該菌不產(chǎn)腸毒素,，也無(wú)侵襲力，致病機(jī)理不清,，約有18個(gè)血清型,。

3）腸侵襲型大腸桿菌（EIEC）：較少見(jiàn)，該菌不產(chǎn)腸毒素,，但侵襲大腸腸壁上皮細(xì)胞,，引起炎癥反應(yīng),，形成潰瘍，約有8個(gè)血清型,。引起類(lèi)似痢疾的癥狀,。

2、腸道外感染

三,、主要癥狀

腸道內(nèi)感染主要造成腹瀉與痢疾樣疾?。荒c道外感染主要引起尿路感染,，新生兒腦膜炎,、敗血癥及其他部位的感染。

致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的綜合作用,，致病性大腸桿菌引起的食物中毒主要癥狀為急性腸胃炎,，潛伏期為12～24小時(shí),，臨床出現(xiàn)嘔吐,、腹瀉、發(fā)熱(體溫一般不超過(guò)39℃),、頭痛,、腹痛等，病程一般為1—3天,。

四,、流行病學(xué)特點(diǎn)

1、發(fā)病季節(jié)多發(fā)生在夏秋季

2,、引起中毒的食品種類(lèi)

與沙門(mén)氏菌相同,。

3、食品種大腸埃希氏菌的來(lái)源

由于大腸桿菌存在于人和動(dòng)物的腸道中,，健康人腸道致病性大腸埃希氏菌率為2—8％,，高者達(dá)44％，而成人患腸炎,、嬰兒患腹瀉時(shí),，致病性大腸埃希氏菌率較健康人高，達(dá)29—52％,。大腸桿菌隨糞便排出而污染水源和土壤,，進(jìn)而直接或間接污染食物。

五,、檢驗(yàn)方法

致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)應(yīng)按《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法(微生物學(xué)部分)》(GB489．6-84)的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行檢驗(yàn),。

（一）增菌培養(yǎng)

1、以無(wú)菌操作的方法稱(chēng)取樣品25g,，加入225ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質(zhì)器打碎樣品,。

2、取適量接種于乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,，測(cè)定大腸菌群MPN,，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培養(yǎng)6小時(shí)。挑取一環(huán),，接種于一管30ml腸道菌增菌湯中,，42℃增菌培養(yǎng)18小時(shí)。

（二）分離培養(yǎng)

1,、將乳糖膽鹽發(fā)酵陽(yáng)性管液與增菌液分別劃線接種于麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上,。

2、于36±1℃培養(yǎng)18—24小時(shí)觀察菌落

對(duì)于污染嚴(yán)重的食品可直接按劃線法接種,，不經(jīng)過(guò)增菌過(guò)程,。

（三）生化試驗(yàn)

1、初篩試驗(yàn)

選取在麥康凱或伊紅美蘭平板上發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌落5個(gè)以上,，分別接種于克氏雙糖鐵,、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．經(jīng)36C培養(yǎng)18～24小時(shí)，棄去H2S陽(yáng)性或尿素酶陽(yáng)性或阿拉伯糖陰性的培養(yǎng)物,。

2,、復(fù)篩試驗(yàn)

把篩留下的培養(yǎng)物分別接種于緩沖葡萄糖蛋白胨和KCN培養(yǎng)基中，經(jīng)36+1℃培養(yǎng)48小時(shí),，觀察生長(zhǎng)結(jié)果并做V-P試驗(yàn),，棄去V-P陽(yáng)性及KCN陽(yáng)性的培養(yǎng)物。

3,、證實(shí)試驗(yàn)

致病性大腸埃希氏菌屬除氧化酶陰性,，革蘭氏陰性的特征以外，還有以下特性：葡萄糖產(chǎn)酸+,，葡萄糖產(chǎn)氣+／一,，乳糖產(chǎn)酸+90％，檸檬酸鹽—,，尿素酶一,，KCN-，V-P-,，動(dòng)力+或—,，阿拉伯糖十，靛基質(zhì)十95％：可按這些主化特性進(jìn)一步證實(shí)其是否為致病性大腸埃希氏菌屬,。

（四）血清學(xué)試驗(yàn)

1,、致病性大腸埃希氏菌血清學(xué)試驗(yàn)

假定試驗(yàn)：

從平板上選菌落生長(zhǎng)稠密處挑取培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希氏菌三種OK多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn),。不凝集的培養(yǎng)物可做陰性報(bào)告,。

證實(shí)試驗(yàn)：

2,、侵襲性大腸埃希氏菌血清學(xué)試驗(yàn)

在平板上菌落生長(zhǎng)稠密處挑取培養(yǎng)物，用侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清做玻片凝集試驗(yàn),，侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清包括兩種：OK多價(jià)血清和9種OK單價(jià)血清：

（五）產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗(yàn)

1,、動(dòng)物試驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)生化證實(shí)試驗(yàn)的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物接種肉湯管，于36+1℃培養(yǎng)24小時(shí),，3000轉(zhuǎn)／分離心30分鐘,。取上清液用G6濾器過(guò)濾后分作兩份，一份加熱60℃30分鐘,，供ST測(cè)定用,，另一份不加熱，供LT測(cè)定用,。

1）家免結(jié)軋回腸段試驗(yàn)：

取體重為2kg的家兔,，禁食使腸內(nèi)容物排空。麻醉后剖腹,，取出回腸段,，按10～15cm為一段，分段結(jié)扎,，取一段注射肉湯2mL作為陰性對(duì)照,，另一段注射已知產(chǎn)毒菌肉湯培養(yǎng)物的上清液2ml作為陽(yáng)性對(duì)照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養(yǎng)物的濾液2mL,。將腹壁縫合。

測(cè)定LT時(shí),，于注射后18小時(shí)剖腹檢查

測(cè)定ST時(shí),，于注射后6—8小時(shí)剖腹檢查

取出腸管分別抽取腸段的積液，測(cè)定其容量,，并測(cè)定腸段的長(zhǎng)度,。積液量(mL)與腸段長(zhǎng)度(cm)之比大于l者為陽(yáng)性。

2）乳鼠灌胃試驗(yàn)：

2,、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

將被檢菌按5點(diǎn)環(huán)形接種于Elek氏培養(yǎng)基上,，以同樣操作共做兩份，36±1℃培養(yǎng)48小時(shí),，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片,，36+1℃經(jīng)5—6時(shí)，使抗生素滲入瓊脂中,，在五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的,，挖一個(gè)直徑4mm的園并用一滴瓊脂墊底。在一份平板的孔內(nèi)滴加LT抗毒素30ul,，另一份平板的孔內(nèi)滴加ST毒素30ul,。放于36+1℃經(jīng)15～20小時(shí)觀察結(jié)果,，在菌斑和抗毒素之間出現(xiàn)白色沉淀帶為陽(yáng)性，無(wú)沉淀帶者為陰性,。

（六）豚鼠角膜試驗(yàn)

供測(cè)定侵襲性大腸埃希氏菌用,，將經(jīng)過(guò)生化證實(shí)試驗(yàn)的待試菌株18—20小時(shí)瓊脂培養(yǎng)物，用肉湯洗下,，使成每lml含菌9億個(gè)菌懸液,，作為接種材料。

體重400--500g的健康豚鼠(角膜與結(jié)膜外觀正常,，并經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)檢查)的角膜上接種待試菌懸液1滴,。

48小時(shí)后觀察結(jié)果，結(jié)膜充血浮腫,、角膜混濁,、眼內(nèi)充盈淚液或漿液性分物者為陽(yáng)性，自結(jié)膜囊取樣分離細(xì)菌,，鑒定應(yīng)與原接種菌一致,。

（七）結(jié)果報(bào)告

根據(jù)以上生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn),、腸毒素試驗(yàn)和豚鼠角膜試驗(yàn)的結(jié)果出報(bào)告,，如果是產(chǎn)毒大腸埃希氏菌時(shí)應(yīng)有腸毒素試驗(yàn)的結(jié)果；如果是侵襲性大腸埃希氏蔭應(yīng)有豚鼠角膜試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果,；如果是腸致病性大腸埃希氏菌時(shí)應(yīng)有血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果,。

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