大鼠滑膜細(xì)胞的制備方法

來(lái)源：武漢尚恩生物技術(shù)有限公司 2022年06月24日 16:14

　　大鼠滑膜細(xì)胞的制備方法：

　　滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)：將分離的滑膜組織用含青霉素200kU/L,、鏈霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以減少污染機(jī)會(huì),；去掉脂肪組織,，將16個(gè)滑膜組織樣本平均分為A,、B兩份,。將A份不加處理分為A1,、A2、A3,、A4,、A5,、A6、A7,、A8八個(gè)樣品,，將B份用手術(shù)剪剪碎后分為B1、B2,、B3,、B4、B5,、B6,、B7、B8八個(gè)樣品,。分別采取4種不同方法進(jìn)行處理,。

　　1)不加消化酶消化法：分別將A1、A2,、B1,、B2離心洗滌2次(2500r/min，離心6min),，吸棄上清液,，加入100μL100%的FBS混勻，用移液槍吸出注入培養(yǎng)瓶中,，放入CO2培養(yǎng)箱烘干15min,，再將A1、B1加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS吹打均勻,，A2,、B2用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS,。

　　2)加Ⅱ型膠原酶消化法：將A3,、A4、B3,、B4離心洗滌2次(2500r/min,，離心6min)，吸棄上清液,，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中,，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶,，放入CO2培養(yǎng)箱消化,，觀察組織成絮狀后，加入1mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化,，用移液槍吸出,，移入離心管離心(2500r/min,，離心6min)，棄上清液,，放入培養(yǎng)瓶中,，A3、B3加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS,，吹打均勻,；A4、B4用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁,，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS,。

　　3)加胰蛋白酶消化法：將A5、A6,、B5,、B6離心洗滌2次(2500r/min，離心6min),，吸棄上清液,，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮,，移入培養(yǎng)瓶,，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后,，加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化,，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min,，離心6min),。棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中,，A5,、B5加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻,；A6,、B6用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS,。

　　4)先加Ⅱ型膠原酶消化法再加胰蛋白酶消化：將A7,、A8、B7,、B8離心洗滌2次(2500r/min,，離心6min)，吸棄上清液,，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中,，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶,，放入CO2培養(yǎng)箱消化,，觀察組織成絮狀后，取出培養(yǎng)瓶,，仔細(xì)吹打使組織塊分散,，將未黏附細(xì)胞移入離心管離心(2500r/min，離心6min),，棄上清液,，再加D-Hank's液洗滌，離心,，吸棄洗滌液,，重復(fù)離心3次，吸取胰蛋白酶至離心管中,，輕輕吹打使組織塊重新懸浮,，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化,，消化結(jié)束取出培養(yǎng)瓶,，加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出,，移入離心管離心(2500r/min,，離心6min)。棄上清液,，放入培養(yǎng)瓶中,，A7、B7加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS,，吹打均勻,；A8、B8用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁,，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS,。

　　5)結(jié)果：培養(yǎng)9d后，觀察各培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的成活個(gè)數(shù)和生長(zhǎng)狀況,，組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞得數(shù)為2.03×106,，是所有培養(yǎng)方法中細(xì)胞的數(shù)最多的。細(xì)胞活力為95%,，與組織剪碎加膠原酶Ⅱ消化后人工貼壁培養(yǎng)同為各種培養(yǎng)方法中細(xì)胞活力*強(qiáng)的,，綜合考慮*方法為組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)。

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