通過閱讀相關(guān)文獻，了解您實驗需要選擇哪些Marker,，以及這些Marker之間的邏輯關(guān)系（圈門的父子關(guān)系,，比如T細胞CD3是“父”,，而CD4或者CD8就是“子”）。

對于細胞質(zhì)或者細胞核的Marker，需要對細胞進行固定破膜/破核膜,。在做胞質(zhì)或胞核Marker染色實驗操作時,，需要先染細胞表面Marker,，再對細胞進行固定破膜,，最后對胞內(nèi)或核內(nèi)Marker染色。此時細胞表面的Marker盡量避免使用串聯(lián)染料,，因為“固定”容易對串聯(lián)熒光素造成影響,。

確認Marker表達位置的同時,，我們還需要了解Marker的表達量,。前面提到過“強弱搭配”，我們需要通過表達量的強弱,，來搭配熒光素的弱強,。

通常，根據(jù)待測細胞類型中,，相應(yīng)抗原的表達量,，可以粗略地將抗原分子分為三類：

步驟三，了解實驗所用流式細胞儀的配置信息,，包括：流式細胞儀的激光器,、檢測通道和濾光片等。

上期提到：流式細胞儀是同時檢測多種熒光的,，這些熒光之間可能存在干擾,。我們需要根據(jù)流式細胞儀的通道,，來確認有哪些熒光素可以選擇，這樣可以在后期搭配的時候,，盡量避免干擾,。如果沒有儀器的通道信息，是無法去確定哪些熒光素可供選擇的,?？梢哉f，如果沒有儀器通道信息,，配色就是“無源之水,，無本之木”。

通過儀器通道信息,，確認可以選擇哪些熒光素后,，我們還需要了解熒光素的信息，確認這些熒光素的激發(fā)波長和發(fā)射波長,、接收該熒光的濾光片等信息,，是否和流式細胞儀的通道一致。

▲ 常見熒光基團信息

強表達抗原,，可以選擇弱熒光素,，也可以選擇強熒光素。

如下圖所示,，強表達抗原CD3,，選擇弱熒光素FITC或強熒光素APC，對實驗結(jié)果影響不大,。

弱表達抗原,，一定要選擇強熒光素。

如下圖所示,，弱表達的抗原CD25,，選擇弱熒光素PerCP，會導(dǎo)致陰陽性細胞群分不開,。如果選擇強熒光素PE,，可以看到明顯的陽性細胞群,。

當(dāng)然,，有些老師在配色時,，也會遇到一些其他的問題，如：細胞樣本有自發(fā)熒光,、細胞處理容易出現(xiàn)死細胞（需要額外增加死活細胞染料）等,。因此，我們需要特別注意,，將對應(yīng)通道的熒光檢測信息,，預(yù)留給自發(fā)熒光，或者死活染料檢測,。

相信在了解了流式配色的基本原則及操作步驟后,，大家的實驗也能更加順利地開展啦~

配色是一個需要多因素考慮的工作，如果您在閱讀完本文后,，具體操作時還是不清楚如何配色,，歡迎填寫下面的配色服務(wù)需求表，我們的技術(shù)支持會給您提供專業(yè)的免費配色服務(wù),。

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