免疫組化中,，組織在福爾馬林或者其他固定液的固定過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)交聯(lián)而引起的抗原決定簇封閉,，極大的降低抗原的檢出率和假陰性現(xiàn)象,。此外，臨床病理診斷中,，免疫組化的應(yīng)用廣泛,，因此抗原修復(fù)成為了免疫組化極其重要的一環(huán)。不同的抗原,，采取不同的適宜的抗原修復(fù)方法,，才能獲得的清晰、有效的結(jié)果,。一般情況下，抗原修復(fù)的方法主要有三大類：高溫高壓修復(fù)法,、微波加熱修復(fù)法,、酶消化法。那我們又該以何種方法來(lái)選擇呢,？

絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)抗原不做任何修復(fù),，一般也能獲得相對(duì)穩(wěn)定的染色結(jié)果,。但采取一些抗原修復(fù)方法，可以是抗原決定簇釋放的更加充分,，進(jìn)一步提高結(jié)果的可靠性和敏感性,。所以我們一般采取的是強(qiáng)度適中，反應(yīng)相對(duì)溫和的抗原修復(fù)方法,。推薦使用微波修復(fù)法,。

推薦的方法：微波加熱修復(fù)法

推薦的修復(fù)液：常用檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：微波高溫加熱 2 min（見(jiàn)微小波動(dòng)，溫度在 90～95 ℃）后,，立即轉(zhuǎn)為保溫 8 min 待緩慢降至室溫,，用蒸餾水沖洗 2 次，加入 3% H2O2 8 ~10 min,，在用蒸餾水沖洗 2 次,，放入 PBS 中并進(jìn)入下一步驟。（提示：在實(shí)際的修復(fù)試驗(yàn)中,，我們還要控制好修復(fù)時(shí)間,，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致過(guò)修復(fù)、組織破壞和非特異性反應(yīng)增強(qiáng)等不利影響）

絕大多數(shù)細(xì)胞膜抗原如果不做任何修復(fù),，它的顯色結(jié)果相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)抗原要微弱一些,。主要是因?yàn)樗奈恢每客猓菀缀凸潭ㄒ旱募兹┌l(fā)生交聯(lián)反應(yīng),，無(wú)論是形成醛鍵還是羧甲基,，都會(huì)造成蛋白構(gòu)象的改變，遮蔽抗原決定簇與抗體連接,。所以在細(xì)胞膜抗原修復(fù)的過(guò)程中,，這個(gè)修復(fù)強(qiáng)度要稍微大一些，我們可以選擇微波加熱或者高壓修復(fù)（如果微波修復(fù)效果不好可以選擇）,。如果是在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn),，保守的選擇微波加熱修復(fù)，不過(guò),，對(duì)于時(shí)間和溫度的控制要稍微加長(zhǎng),，溫度也可以略微高一些。

推薦的方法：微波加熱修復(fù)法

推薦的修復(fù)液：檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）或 EDTA（pH=8.0 或 9.0）,，通常EDTA緩沖液的修復(fù)效果要優(yōu)于檸檬酸鹽緩沖液,，國(guó)外很多實(shí)驗(yàn)室傾向于應(yīng)用 DTA（pH=8.0 或 9.0）來(lái)修復(fù)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：微波高溫加熱 3 min（加熱到沸騰,，95～100 ℃,，一定要保證里面有充足的修復(fù)液，防止干片）后,，立即轉(zhuǎn)為保溫 15 min 待緩慢降至室溫,，用蒸餾水沖洗 2 次,，加入 3% H2O2 8～10 min，在用蒸餾水沖洗 2 次,，放入 PBS 中并進(jìn)入下一步驟,。（提示：在實(shí)際的修復(fù)試驗(yàn)中，我們還要控制好修復(fù)時(shí)間,，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致過(guò)修復(fù),、組織破壞和非特異性反應(yīng)增強(qiáng)等不利影響）

細(xì)胞核抗原處在細(xì)胞的最核心位置，它的修復(fù)難度要大于細(xì)胞質(zhì)抗原和細(xì)胞膜抗原,。幾乎所有的的細(xì)胞核抗原需要應(yīng)用高壓 120 ℃ 熱修復(fù)才可以達(dá)到理想的效果,，使用其他方法都很難見(jiàn)到不錯(cuò)的效果。由于高壓熱修復(fù)的強(qiáng)度要大一些,，本身容易脫片,，所以我們?cè)趯?shí)驗(yàn)的時(shí)候要做好切片的固定，這個(gè)有很多方法可以實(shí)現(xiàn),，比如烤片的時(shí)間控制,、添加一些切片的粘合劑等等，大家結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)來(lái)安排,。關(guān)于修復(fù)液的選擇,，如果目的抗原真的很難修復(fù)，可以選擇 pH=8.0 或 9.0 的 EDTA 緩沖液,。有文獻(xiàn)描述說(shuō)pH的大小與抗原修復(fù)效果成正比,，這是因?yàn)樵诩訜峄蛘咭后w中的堿性物質(zhì)可以引起蛋白質(zhì)分子之間的曼尼希反應(yīng)，非常容易破壞蛋白質(zhì)分子的交聯(lián),?？蓪ｉT(mén)用來(lái)針對(duì)那些有難度的細(xì)胞核抗原的修復(fù)，也就是說(shuō) EDTA 緩沖液的修復(fù)效果要優(yōu)于檸檬酸鹽緩沖液,，國(guó)外很多實(shí)驗(yàn)室也傾向于應(yīng)用DTA（pH=8.0 或 9.0）來(lái)修復(fù)（有時(shí)間最好兩種修復(fù)液都做一下,，加深感受，有助于提升實(shí)驗(yàn)技能）,。

推薦的方法：高壓熱修復(fù)法

推薦的修復(fù)液：檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）或 EDTA（pH=8.0 或 9.0）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：高壓鍋加熱到噴氣開(kāi)始再加熱 2 min（一定要保證里面有充足的修復(fù)液,，防止干片）后，立即將高壓鍋端離火源,，一定要等蒸汽排放完成以后,，再打開(kāi)鍋蓋，待緩慢降至室溫,，用蒸餾水沖洗 2 次,，加入 3% H2O2 8 ~10 min，在用蒸餾水沖洗 2 次，待進(jìn)入下一步驟,。（提示：在實(shí)際的修復(fù)試驗(yàn)中，我們還要控制好修復(fù)時(shí)間,，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致過(guò)修復(fù),、組織破壞和非特異性反應(yīng)增強(qiáng)等不利影響）

免疫組化中一些特殊類型的修復(fù)，都是一些經(jīng)驗(yàn)性的總結(jié),，比如 CD4/CD8/CD25/CD1a 需先用 3% H2O2 浸泡 8 min,，后用蒸餾水沖洗兩次，再用高壓熱修復(fù)法進(jìn)行修復(fù),。其染色結(jié)果就非常理想,，反之陽(yáng)性信號(hào)減少，陽(yáng)性細(xì)胞也變少了,。還有一些抗原修復(fù)以后反而假陰性大大增加,。舉個(gè)例子 HBcAg 是乙肝病毒的核殼結(jié)構(gòu)蛋白，是 HBV 的核心部分,。黃建平等對(duì)其進(jìn)行 3 種抗原修復(fù)的方法對(duì)比發(fā)現(xiàn),，不修復(fù)染色最好，高壓熱修復(fù)效果最差,。原因是因?yàn)榧兹┕潭ǖ氖歉渭?xì)胞,，并沒(méi)有固定到乙肝病毒上。高溫高壓的修復(fù),，反而導(dǎo)致乙肝病毒的蛋白質(zhì)變性,，極大的影響了染色結(jié)果。對(duì)于特殊類型抗原的修復(fù),，是因?yàn)槲覀儗?duì)抗原修復(fù)的機(jī)制研究尚不*,，還有很多問(wèn)題沒(méi)有搞清楚。這種方法的積累來(lái)源于實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的積累和汲取,，所以鼓勵(lì)大家多看看相關(guān)類型文獻(xiàn),，可以幫助少走彎路。