陽性對照（Positive Control）是已知或*有目的蛋白表達的樣本,。當對一個靶標并無檢測經驗時,，在實驗初期,，強烈建議增加陽性對照幫助排查一系列問題，例如,，待測樣本中該靶標的表達量,、操作步驟、抗體表現(xiàn)等,。

而內參蛋白如 β-actin, GAPDH 等,，一般在樣本中高表達，作為管家蛋白而用來對比不同樣本間的上樣量 (Loading Control),，并非目的蛋白的陽性對照,。

與陽性對照相對應的，還有陰性對照,，即不表達靶標蛋白的樣本,。如圖 1 所示，利用使用抑制劑或生長因子處理,，制備針對 p-AKT(Ser473) 的陰性或陽性對照,。

圖 1：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb #4060（上）或 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（下），對未經處理或經 LY294002/Wortmannin 處理的 PC-3 細胞,、經血清饑餓或 PDGF 處理的 NIH/3T3 細胞提取物進行蛋白質印跡分析,。

a. 總蛋白的陽性對照

選用明確表達該蛋白的細胞或組織樣本,；可參考說明書示例圖或數(shù)據(jù)庫,。如下圖所示，Saos-2 細胞高表達 RUNX2,，適宜作為陽性對照樣本,，而 LNCaP 細胞不表達該靶標。

圖 2：使用 RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb #12556 和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457,， 對 Saos-2 和 LNCaP 細胞的提取物進行蛋白質印跡分析,。

b. 翻譯后修飾蛋白的陽性對照

并非所有的細胞都有基礎的翻譯后修飾水平（如磷酸化）的表達,。如圖 3 所示,，不同的細胞 p-AKT(Ser473) 的基礎水平差別非常大。有些靶標需要合適的刺激條件（包括誘導因子,、劑量和時間窗）使蛋白獲得修飾,。您可查看說明書、陽性對照處理表,，或者通過廣泛閱讀文獻,，了解處理方式，并結合預實驗摸索條件,。

圖 3：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb 檢測不同樣本中靶標的表達,。

圖 4：使用 Cell Fractionation Kit #9038，對 HeLa 細胞的細胞組分進行蛋白質印跡分析,，結果表明蛋白在細胞漿,、細胞器/膜以及胞核/細胞骨架的定位。全細胞裂解物 (WCL) 表示總蛋白,。細胞漿蛋白 (Cyto) 使用 CIB 緩沖液進行分離,。膜和細胞器蛋白 (Mem) 使用 MIB 緩沖液進行分離。胞核和細胞骨架蛋白 (Nuc) 使用 CyNIB 緩沖液分離,。

樣本裂解后，建議進行超聲。超聲可以破壞膜結構,，斷裂 DNA,，降低樣本的粘稠度，讓樣本更加均質化,，增加蛋白的溶解,，提高實驗結果的一致性。對于核蛋白或者膜相關蛋白,，超聲步驟尤為重要 (圖 5),。

超聲步驟為冰上 3 次  5 秒的超聲（50% 輸出功率），控制超聲探頭位置,，避免產生氣泡,。如沒有超聲儀，可用 1 mL 注射器針頭,，冰上反復抽打裂解液 5~10 次,，達到類似于超聲的效果。

圖 5：使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody#9701 對超聲或者未經超聲處理的細胞裂解液進行檢測

封閉的目的是減少由一抗或二抗的非特異性結合引起的背景,。BSA 僅含有一種蛋白質，分子量為 60KD,。而奶粉則含有多種蛋白質,，所以封閉作用更佳（圖 6）。

有文章指出奶粉中的磷酸酶可影響磷酸化信號,，那磷酸化蛋白還能用牛奶嗎,？我們的回答：是的。二十余年的磷酸化蛋白抗體研發(fā)經驗告訴我們,，新鮮配置的牛奶不會對磷酸化信號產生任何影響,，但隨著牛奶儲存時間的延長（即便在 4 ℃），就可能使磷酸化信號下降,。且牛奶封閉更加全面,，使得磷酸化靶標識別特異性更佳。

圖 6：使用 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP^® Rabbit mAb #13038,，檢測經 PDGF 處理的 3T3 細胞樣本,，BSA 封閉的結果中可見背景和雜帶，而牛奶封閉的結果背景更干凈,，信號強且清晰,。

封閉時使用 5% 脫脂奶粉-TBST,，搖床上室溫封閉 1 h,。如后續(xù)使用熒光發(fā)光法，則封閉時不可含有 Tween^® 20。二抗孵育時,，也推薦用 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋二抗,，降低背景。注意,，需使用實驗級脫脂奶粉（Nonfat Dry Milk #9999）,，食品級奶粉不可用于實驗。