規(guī)格:100管/96樣
葡萄糖含量試劑盒說(shuō)明書(shū)(測(cè)組織,、細(xì)菌或細(xì)胞)
微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物,,而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物,。植物可通過(guò)光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言,,葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng),、肌肉,、脂肪組
織等的唯*#一能源,,而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān),。
測(cè)定原理:
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,,并產(chǎn)生過(guò)氧化氫;過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,生成有色化合物,,在 505 nm 有特征吸收峰,。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水
試劑的組成和配制:
試劑一:0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,,4℃保存,;
試劑二:液體 10ml×1 瓶,4℃保存,;
試劑三:液體 10ml×1 瓶,,4℃保存;
葡萄糖提?。?/font>
1,、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),,研磨成勻漿,,95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),,冷卻后,,8000g,25℃離心10min,,取上清液備用,。
2、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),,離心后棄上清,;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,,功率20%或200W,,超聲3S,間隔10S,,重復(fù)30次),,95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),,冷卻后,,8000g,25℃離心 10min,,取上清液備用,。
測(cè)定步驟:
1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm,,蒸餾水調(diào)零,。
2、混合試劑的配制:使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合,,用多少配多少,。
3、加樣表(在EP管或96孔板中加入下列試劑):
試劑(μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
樣本 |
|
| 20 |
試劑一 |
| 20 |
|
蒸餾水 | 20 |
|
|
混合試劑 | 180 | 180 | 180 |
混勻,,置 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25'C(其它物種)保溫 15min 后,,于 505nm 波長(zhǎng)處讀取吸光
度??瞻坠?、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3,??瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
葡萄糖含量計(jì)算:
1,、按樣本蛋白濃度計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)
=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr,。
2、按樣本鮮重計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/g 鮮重)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)
=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W
3,、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/104cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)
=0.001×(A3-A1)÷(A2-A1)
C 標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)管濃度,,0.5µmol/mL;V1:加入樣本體積,,0.1mL,;V2:加入提取液體積,1mL,;
Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,,mg/mL;W:樣本鮮重,,g,;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn),。
注意:最*-低檢測(cè)限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
|
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