pBM16A Toposmart Cloning Kit

 

 

產(chǎn)品信息：
組 成	YCL071-01	YCL071-02
pBM16A Vector (20ng/ml )	20ml	20ml×3
10×Toposmart	20ml	20ml×3
Control Insert	5ml	5ml
M13F Primer	0.1OD	0.1OD×3
M13R Primer	0.1OD	0.1OD×3

保存條件：-20℃保存，有效期一年,。

產(chǎn)品介紹：

pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構(gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中,。不僅適用于克隆由Pfu、KOD,、Xerox,、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物，也可克隆由Taq,、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產(chǎn)物,。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒?？梢杂靡飳?/font>M13F和M13R進行菌落PCR鑒定陽性克隆,。

產(chǎn)品特點：

（1）連接反應僅需5 分鐘。

（2）適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物,。

（3）載體采用了新的制備工藝,，無需藍白斑篩選。

1. 克隆位點兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點,，適合單酶切鑒定,。
2. 載體具有氨芐青霉素抗性。

操作步驟：

1. 連接反應

按下表,，在一個0.2ml PCR 管中依次加入加完試劑后,，輕輕混勻低速離心，使溶液集中在管底,。

成分	體積
DNA -*片段	0.5-8µl
pBM16A Topo載體	1ml
10×Toposmart	1ml
補水至總體積	10ml

 注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水?。┥喜僮鳌?/font>

 2. 反應溫度及片段要求

室溫下（20-30℃）放置 0-5 分鐘,，然后將離心管放置在冰上,。如當天不進行轉(zhuǎn)化實驗。請將連接產(chǎn)物置于-20℃保存,。

注意：DNA-*片段的用量見下表

 

片段大?。?/span>bp）	建議用量（ng）
100-1000	20-50
1000-2000	50-100
2000-5000	100-200

 

室溫下（20-30℃）反應時間 5-30 分鐘，如果室溫較低,，推薦使用 PCR 儀器控制溫度,。可以設置 25℃反應 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,，無引物二聚體和非特異性條帶存在,，可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進行克隆。

3. 陽性對照反應

取1µl 試劑盒提供的1kb長度的對照片段LacZ 基因α肽片段進行克隆,，轉(zhuǎn)化具有α 互補功能的大腸桿菌感受態(tài)細胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）,。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上,，次日藍色菌落為陽性克隆，說明有片段插入,，白色菌落為空載體,。

4. 轉(zhuǎn)化

1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細胞中，輕輕混勻,，冰浴2-30 分鐘,。

2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

3. 立刻置于冰水浴中2 分鐘,。

加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB,，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘,。

注：小于 2kb 片段可以不復蘇,，直接涂平板,。

• 吸取200µl 菌液涂布,。為了得到更多的菌落，可以先4000rpm 離心1 分鐘,，去掉部分上清,，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液,，取全部菌液涂布,，然后 37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時）。

5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR

（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中,，吹打混合,。

② 25ml PCR反應體系：取2μl細菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各

1μl進行PCR擴增,。

③PCR擴增條件：95℃預變性5分鐘（裂解細胞,，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘,，55℃退火10秒鐘,，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時間，通常每1min/1kb）X秒,，30個循環(huán),，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果,，有強烈的明顯條帶的克隆為重組體,，與插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大138bp） 可視為陽性克隆,。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照,。

（2） 測序：用M13F,、M13R通用引物對陽性質(zhì)粒進行測序分析。

pBM16A載體圖譜

 

常見問題分析

 

重組子克隆菌少,，或陽性率低：

(1) 感受態(tài)效率低,，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細胞

(2) 連接反應在低溫下（如放碎冰上）操作，應該在室溫下操作,。

(3) PCR 片段加入量太多或太少,，按照推薦量加入。

(4) PCR 純度低,，重新擴增或重新純化PCR 產(chǎn)物,。

(5) PCR 質(zhì)量低，切膠時在紫外下照射時間長,，需重新制備,。

(6) PCR 擴增結(jié)束后，應該再延伸5-10 分鐘,，確保片段延伸*,。

(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復蘇培養(yǎng)，可以加入SOC 或LB,，培養(yǎng)60分鐘,。

• 克隆基因可能對宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因,，某些啟動子和調(diào)節(jié)序列基因,，或含有倒置或串聯(lián)重復序列的基因，選用室溫過夜培養(yǎng)平板,。

載體序列：

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

                                                           本產(chǎn)品僅供研究不用于臨床診斷

實驗代做服務：