pBM16A Toposmart Cloning Kit

保存條件：-20℃保存,，有效期一年。

產(chǎn)品介紹：

pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由Pfu,、KOD,、Xerox,、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物,，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴(kuò)增的帶A尾的PCR產(chǎn)物,。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒,。可以用引物對M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆,。

產(chǎn)品特點：

（1）連接反應(yīng)僅需5 分鐘,。

（2）適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物。

（3）載體采用了新的制備工藝,，無需藍(lán)白斑篩選,。

1. 克隆位點兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點，適合單酶切鑒定,。
2. 載體具有氨芐青霉素抗性,。

操作步驟：

1. 連接反應(yīng)

按下表，在一個0.2ml PCR 管中依次加入加完試劑后,，輕輕混勻低速離心,，使溶液集中在管底。

 注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水?。┥喜僮?。

 2. 反應(yīng)溫度及片段要求

室溫下（20-30℃）放置 0-5 分鐘,，然后將離心管放置在冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗,。請將連接產(chǎn)物置于-20℃保存,。

注意：DNA-*片段的用量見下表

室溫下（20-30℃）反應(yīng)時間 5-30 分鐘,，如果室溫較低,，推薦使用 PCR 儀器控制溫度。可以設(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘,。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,，無引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進(jìn)行克隆,。

3. 陽性對照反應(yīng)

取1µl 試劑盒提供的1kb長度的對照片段LacZ 基因α肽片段進(jìn)行克隆,，轉(zhuǎn)化具有α 互補(bǔ)功能的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上,，次日藍(lán)色菌落為陽性克隆,，說明有片段插入，白色菌落為空載體,。

4. 轉(zhuǎn)化

1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻,，冰浴2-30 分鐘,。

2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

3. 立刻置于冰水浴中2 分鐘,。

加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB,，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘,。

注：小于 2kb 片段可以不復(fù)蘇,，直接涂平板。

• 吸取200µl 菌液涂布,。為了得到更多的菌落,，可以先4000rpm 離心1 分鐘，去掉部分上清,，用移液器輕吹菌體,，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布,，然后 37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時）,。

5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR

（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中，吹打混合,。

② 25ml PCR反應(yīng)體系：取2μl細(xì)菌懸液為模板,、加入5μM 濃度的M13F/M13R各

1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

③PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶）,，94℃變性10秒鐘,，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時間,，通常每1min/1kb）X秒,，30個循環(huán)，72℃后延伸5分鐘,。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果,，有強(qiáng)烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè),，所以PCR擴(kuò)增出的DNA的長度比插入片段大138bp） 可視為陽性克隆,。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設(shè)立一個不加菌液的陰性對照。

（2） 測序：用M13F,、M13R通用引物對陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序分析,。

pBM16A載體圖譜

重組子克隆菌少，或陽性率低：

(1) 感受態(tài)效率低,，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細(xì)胞

(2) 連接反應(yīng)在低溫下（如放碎冰上）操作,，應(yīng)該在室溫下操作。

(3) PCR 片段加入量太多或太少,，按照推薦量加入,。

(4) PCR 純度低，重新擴(kuò)增或重新純化PCR 產(chǎn)物,。

(5) PCR 質(zhì)量低,，切膠時在紫外下照射時間長，需重新制備,。

(6) PCR 擴(kuò)增結(jié)束后,，應(yīng)該再延伸5-10 分鐘，確保片段延伸*,。

(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復(fù)蘇培養(yǎng),，可以加入SOC 或LB，培養(yǎng)60分鐘,。

• 克隆基因可能對宿主菌有毒性,，比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因，某些啟動子和調(diào)節(jié)序列基因,，或含有倒置或串聯(lián)重復(fù)序列的基因,，選用室溫過夜培養(yǎng)平板。