多肽抗原免疫
抗原準(zhǔn)備－交聯(lián)方法
化學(xué)合成的多肽抗原是小分子， 本身很難具有好的抗原性,，只能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生很弱的免疫反應(yīng),，因而與載體蛋白交聯(lián)是很重要的,。載體蛋白含有很多抗原決定基,，能夠刺激T－幫助細(xì)胞,，進(jìn)而誘導(dǎo) B－細(xì)胞反應(yīng),。用于與多肽交聯(lián)的載體蛋白有多種,，其中常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白（bovine serum albumin,，BSA）, 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin,，THY),。KLH具有更高的抗原性，是為常用的多肽交聯(lián)載體,。BSA也常用來作為多肽載體,，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試驗(yàn)的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。
設(shè)計(jì)合成性多肽常常被忽略的一個(gè)方面是如何將多肽交聯(lián)到載體蛋白上,。例如,，N－端序列需要通過C－端氨基酸交聯(lián)，而C－端序列則需要通過N－端氨基酸交聯(lián),。內(nèi)部序列則可以交聯(lián)到任何一端,。內(nèi)部序列交聯(lián)的另一考量則是將非共軛端酰基化或氨基化,，因?yàn)樵鞍追肿有蛄兄胁粫?huì)含有帶電荷的末端,。常用的交聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集團(tuán)(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在,。的交聯(lián)方法都應(yīng)該是通過羧基或氨基端殘基將多肽交聯(lián)到載體蛋白上,。所選序列不能有多個(gè)殘基都能參與所選交聯(lián)化學(xué)反應(yīng)。如果多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)存在,，可以考慮將多肽序列縮短,，或者選擇反應(yīng)位點(diǎn)都位于一端的多肽。對(duì)于內(nèi)部序列通常會(huì)使用離所預(yù)測抗原位點(diǎn)較遠(yuǎn)的一端進(jìn)行交聯(lián),，這樣可以避免可能的屏蔽問題,。
動(dòng)物選擇
要生成好的抗體，必須選擇與抗原源差異較大的動(dòng)物,。要想獲得大的免疫反應(yīng),，不能讓免疫動(dòng)物對(duì)抗原產(chǎn)生‘自體識(shí)別’。例如,，要想生成抗人體蛋白的抗體,，使用兔或老鼠比使用猴子要好。對(duì)于非常保守的哺乳動(dòng)物蛋白,，使用鳥類動(dòng)物（如雞）效果較好,。
動(dòng)物免疫
我們通常使用弗氏佐劑（Freunds）與抗原進(jìn)行混合。次注射*使用Freunds的免疫輔助劑。輔助劑與抗原聯(lián)合使用,，可以提高免疫反應(yīng),，從而用較少的疫苗可以產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。佐劑可以使抗原緩慢釋放,，從而產(chǎn)生持續(xù)性刺激,。注射方式為多位點(diǎn)的皮下注射。每只注射動(dòng)物都要先收集免疫前血樣,，以用于和以后的免疫血樣比較,。所采集的血清樣本含有不同的免疫型和亞型。
抗體鑒定
檢測抗多肽反應(yīng)是否發(fā)生的簡單方法就是抗多肽ELISA,。有兩種技術(shù)可以將多肽鏈接到ELISA板上,。種方法就是直接將多肽鏈接到盤上。但如果鏈接氨基酸恰好是抗原決定簇的一部分,，則抗體無法和多肽進(jìn)一步鏈接,，這樣產(chǎn)生假陰性結(jié)果的可能性增加。第二種方法則是先將多肽與載體蛋白耦合,，然后將多肽－蛋白 耦合體鏈接到ELISA盤上,。這種鏈接方法會(huì)使抗體－多肽的結(jié)合成功率提高，因?yàn)槎嚯牟皇侵苯忧度氡P膜,，因而會(huì)更加暴露給抗體,。這種方法因而更可靠，可重復(fù)性更高,。需要注意的是,，用于該方法的載體蛋白必須不同于用于免疫耦合的載體蛋白。這樣會(huì)避免血清中抗載體蛋白反應(yīng)所導(dǎo)致的高背景反應(yīng),。
當(dāng)做血清檢測時(shí),，另一點(diǎn)需要記住的是，由于免疫多肽與自然多肽結(jié)構(gòu)上的差別,，檢測時(shí)的抗多肽反應(yīng)與試劑的抗多肽反應(yīng)可能是不同的。任何檢測,，尤其是測定滴定量以決定收獲點(diǎn)時(shí),，必須包括針對(duì)天然狀態(tài)下蛋白的檢測。當(dāng)然可以做針對(duì)天然狀態(tài)下蛋白的ELISA,；但由于血清在不同檢測體系中表現(xiàn)會(huì)不一樣,，因此好在血清被日常使用的體系中進(jìn)行蛋白識(shí)別鑒定。如果血清將用于免疫沉淀反應(yīng),，就應(yīng)該進(jìn)行針對(duì)該反應(yīng)的檢測,。
多肽的序列的設(shè)計(jì)
多肽是用來模擬蛋白的，為了模仿蛋白的表現(xiàn)，我們需要合成與蛋白有相似的結(jié)構(gòu)和電荷的多肽 ,。當(dāng)一條肽段從一個(gè)蛋白中“切出”之后,，兩端的電荷數(shù)將與基因體蛋白有差異。我們需要改變合成策略來使他們一致,。
總體而言：
如果是出自蛋白C端的序列,，通過乙酰化將N端屏蔽,；
如果是出自蛋白N端的序列,，通過酰胺化將C端屏蔽；
如果是出自蛋白中間部分,，用乙?；王０坊瘜啥硕计帘?br />多肽純度的定義
多肽的純度通常是通過HPLC，用每分鐘1%的標(biāo)準(zhǔn)乙腈梯度來檢測決定的,。合成過程中,，氨基酸之間的交聯(lián)效率不是總能達(dá)到100%，因而產(chǎn)生一系列的氨基酸缺失的雜質(zhì),。大多數(shù)這樣的氨基酸缺失的雜質(zhì)在純化過程中都被去掉了,，但有少數(shù)的雜質(zhì)其色譜表現(xiàn)與目標(biāo)多肽很相近。這些氨基酸缺失的雜質(zhì)肽留在了多肽樣品中就構(gòu)成了余下的幾個(gè)百分點(diǎn),。
多肽的凈含量
干品多肽的重量中不僅僅包含多肽,，還包含有一些非肽的組份，如水,，被吸收的溶劑,、配位離子和鹽等。 肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比,，這個(gè)百分比的數(shù)值范圍很大,，可能從50%到90%，取決于純度,、序列以及合成和純化的方法,，不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談， 它們是*不同的兩個(gè)概念,。純度通常是由HPLC決定的,。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比， 而肽的凈含量是指樣品中肽類物質(zhì)相對(duì)于總物質(zhì)所占的百分比,，肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測定的,。這個(gè)信息主要是在一些對(duì)肽的濃度很敏感的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)計(jì)算肽的濃度是很重要的,。
MAP的應(yīng)用
MAP是復(fù)合抗原多肽,，是將線型多肽的C端連接在多聚Lys核心上形成的分枝多肽,，從而增大了整個(gè)分子的大小。雖然MAP減少了多肽與KLH交聯(lián)的步驟,，然而由于MAP多肽的構(gòu)象活動(dòng)空間有限,，通過它產(chǎn)生的抗體與通過KLH交聯(lián)法產(chǎn)生的抗體相比常常不能被蛋白識(shí)別。再者,，做MAP時(shí)沒有自由的肽產(chǎn)生,，因而很難除去對(duì)多聚Lys核心部分產(chǎn)生的抗體。HPLC純化MAP很困難,。而且由于MAP分子的不均一性和很大的分子大小,，也不能提供質(zhì)譜鑒定。
抗原多肽交聯(lián)中常見問題
1,、多肽與載體蛋白交聯(lián)
對(duì)在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)而言,，大多數(shù)多肽的分子量都太小。將多肽與載體蛋白如KLH等交聯(lián)之后,，不僅能增加抗原的大小,，也能增強(qiáng)免疫性。我們可以提供與KLH和BSA兩種蛋白的交聯(lián),。大多數(shù)客戶選擇與KLH交聯(lián),，因?yàn)镵LH的免疫性更好，而且BSA在很多實(shí)驗(yàn)中作為Blocking試劑,，由于動(dòng)物體內(nèi)既會(huì)產(chǎn)生對(duì)多肽的抗體也會(huì)產(chǎn)生對(duì)載體蛋白的抗體,，這樣會(huì)出現(xiàn)假陽性。
2,、抗體的使用
由于抗體與很多生物分子,，以蛋白和多肽等尤為顯著，有很強(qiáng)的結(jié)合能力,，抗體在生物醫(yī)學(xué)研究中占據(jù)*的重要地位,，在對(duì)蛋白的特性、含量的測定,、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都需要用到抗體,。例如：診斷試劑盒如早孕試劑盒等，蛋白microalloy,、immunohistochemistry 和普通的ELISA實(shí)驗(yàn)等,。由于抗體有對(duì)特定分子很強(qiáng)的結(jié)合能力的特點(diǎn)，用抗體進(jìn)行體內(nèi)治療成了許多努力的方向,。成功的范例包括Genetech的Herceptin,用于治療一類特殊的乳腺癌和IDEC藥業(yè)公司的Ritaxan，用于特定類型的Non-Hodgkin`s Lymphomas B-細(xì)胞,。
3,、抗原和識(shí)別區(qū)域：
大多數(shù)情況下，antigen和immunogen兩個(gè)字是可以互換使用的，它們的差別是很小的,。他們是分別指一個(gè)分子與免疫系統(tǒng)之間的兩種類型的相互作用,。一個(gè)immunogen是指能使一個(gè)生物組織的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的分子，而一個(gè)antigen是指能與這種免疫反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)合的分子,，所以immunogen一定是antigen,，但antigen不一定是immunogen，我們這里通用antigen,，特指能與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物—抗體結(jié)合的分子,。
識(shí)別區(qū)域（epitopes）是指一個(gè)抗原分子中一個(gè)與抗體直接結(jié)合的一段特定的序列，對(duì)于任何抗原（抗原蛋白）,，很有可能有多個(gè)抗體識(shí)別區(qū)域,，對(duì)生產(chǎn)抗體而言，易于抗體識(shí)別的部位的識(shí)別區(qū)域?yàn)槔硐搿?br />4,、進(jìn)行KLH交聯(lián)的化學(xué)方法
我們用MBS活化KLH,，這樣能將載體蛋白（KLH）上面的自由-SH與多肽末端的Cys的側(cè)鏈-SH連接起來，這種方法直接,，特異性高,，而且穩(wěn)定，通常選擇對(duì)免疫不重要的一端進(jìn)行交聯(lián),。
EDC活化載體上的-COOH,，將載體的-COOH和多肽的-NH2連接起來也是一種可行的方法。但我們只建議在多肽序列中有多個(gè)Cys時(shí)采用該方法,。如果肽鏈中含有多個(gè)-COOH或-NH2基因,，不建議使用該方法，因?yàn)闀?huì)造成多重點(diǎn)交聯(lián)的情況,，使多肽結(jié)構(gòu)受影響,。常用載體蛋白除KLH外，還有BSA,，Ovalbumin等,，造成KLH的優(yōu)勢是它不干擾ELISA或Western Blot等實(shí)驗(yàn)。
5,、對(duì)抗原多肽交聯(lián)合適的肽鏈長度
通常建議10-15個(gè)殘基進(jìn)行交聯(lián),。肽鏈越長，抗體識(shí)別的區(qū)域越多,，但也就越多機(jī)會(huì)形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),。就不再是天然的形式了。太短的肽通常是沒有用的,，除非有充足的理由,，如與相關(guān)家族蛋白或其他蛋白有序列同源性等,。
6、KLH交聯(lián)多肽溶液呈乳狀的原因
KLH是一個(gè)很大的并且聚合的蛋白,。因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)和大小,，它在水中的溶解度是很有限的，因此是乳狀,，這并不影響它的免疫性,，這種混濁的溶液可以直接免疫動(dòng)物。
7,、抗體的產(chǎn)量
抗體的產(chǎn)量取決于很多因素：識(shí)別區(qū)域的選擇,，多肽的合成，載體的交聯(lián),，免疫的操作步驟和動(dòng)物的生理系統(tǒng)等等,，因此抗體的產(chǎn)量是不等的。5-25mg都屬于正常范圍,。

國肽生物主要提供：多肽合成,、多肽定制、同位素標(biāo)記肽,、人工胰島素,、磷酸肽、生物素標(biāo)記肽,、熒光標(biāo)記肽（Cy3,、Cy5、Fitc,、AMC等）,、目錄肽、偶聯(lián)蛋白（KLH,、BSA,、OVA等）、美容肽,、化妝品肽,、多肽文庫構(gòu)建、抗體服務(wù),、糖肽,、訂書肽、藥物肽,、RGD環(huán)肽等,。

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