【技術(shù)文章】細(xì)胞養(yǎng)不好？這些注意事項(xiàng)請(qǐng)收好（三）

1,、購(gòu)買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因,？細(xì)胞冷凍管解凍后，為何會(huì)有細(xì)胞數(shù)目太少的情形,？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳,；解凍過程錯(cuò)誤,；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心,；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

研究人員在冷凍細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失,。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

2,、收到的冷凍管瓶身破裂,，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因,？

冷凍管瓶蓋裂紋,，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),，造成冷凍管裂損,，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象,，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊,。

3、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基,？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長(zhǎng),?？傊x MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng),，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始,，各種目的無血清培養(yǎng)shou選 AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

4,、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎,？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的,。脫掉氨基后,，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,，但是確切的降解率一直沒有終定論,。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性,。

5,、GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I,？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定,？

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè) L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護(hù),。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定,，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘,，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎*降解,。

6、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色,，堿性時(shí)為紫色,。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應(yīng),，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,，但是，如果沒有葡萄糖的話,，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉,。

7、為什么目錄上說 Hank's 平衡鹽溶液 （HBS） 在空氣中使用,，不需要 CO2 培養(yǎng)箱,？HBS 和 Earle's 平衡鹽溶液 （EBS） 有什么本質(zhì)的功能差別,？

HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在 Eagles （2.2 g/L） 中比在 Hanks （0.35 g/L） 中高,。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡,，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中,，溶液會(huì)變堿,，Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用 Eagles 液,，如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用 Hanks 液就可以了,。

8,、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入 EDTA 的目的是什么,？

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性,。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性,。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,，用 EDTA 清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子,。

9,、其他注意事項(xiàng)

o 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%,。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素,。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活,，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平,。

o 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它,。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解,。

o 大部分添加物和試劑多可以凍融 3 次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,，將會(huì)影響它的性能,。

o 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解,，如果在室溫下放置超過 30 分鐘,，就會(huì)變得不穩(wěn)定。

o 為了保持 CO2 培養(yǎng)箱水盤清潔，需定期 （至少每?jī)芍芤淮危?用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換,。