1．費(fèi)氏弧菌發(fā)光桿菌斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,，待菌充分生長(zhǎng)后,，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏,。

保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同,，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月,，移種一次,。酵母菌兩個(gè)月,，細(xì)菌每月移種一次。

此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法,，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,，使用方便，不需特殊設(shè)備,，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡,、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異,，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理,、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變,，而影響微生物的性狀,；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。

2．液體石蠟保藏法

（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi),，塞上棉塞,，并用牛皮紙包扎，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉,，備用,。

（2）將需要保藏的菌種，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使得到健壯的菌體或孢子,。

（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好菌的斜面上,，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn),，使菌種與空氣隔絕。

（4）將試管直立,，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長(zhǎng)）,。

此法實(shí)用而效果好。霉菌,、放線菌,、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年,，一般無(wú)芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右,，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久,。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單,，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種,。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置,，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶,。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后,，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,，應(yīng)特別注意,。

3．濾紙保藏法

（1）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中,，每管1—2張,，塞以棉塞，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,。

（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),，使充分生長(zhǎng),。

（3）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻,，制成濃懸液,。

（4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽,，再放回至安瓿管中，塞上棉塞,。

（5）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中,，用真空泵抽氣至干。

（6）將棉花塞入管內(nèi),，用火焰按圖Ⅶ-13熔封,，保存于低溫下。

（7）需要使用菌種,，復(fù)活培養(yǎng)時(shí),，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位,，使玻璃破裂,，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開(kāi)啟后，取出濾紙,，放入液體培養(yǎng)基內(nèi),，置溫箱中培養(yǎng)。

細(xì)菌,、酵母菌,、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右,，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久,。此法較液氮、冷凍干燥法簡(jiǎn)便,，不需要特殊設(shè)備,。

4．沙土保藏法

（1）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘,，以去除其中的有機(jī)質(zhì),。

（2）倒去酸水，用自來(lái)水沖洗至中性,。

（3）烘干,，用40目篩子過(guò)篩，以去掉粗顆粒,，備用,。

（4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次,，直至中性,。

（5）烘干，碾碎,，通過(guò)100目篩子過(guò)篩,，以去除粗顆粒。

（6）按一份黃土,、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例,，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中,，每管裝1g左右,，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌,，烘干,。

（7）抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢查，每10支沙土管抽一支,，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌,，再作無(wú)菌試驗(yàn),，直至證明無(wú)菌，方可備用,。

（8）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長(zhǎng)豐滿的,，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種，以無(wú)菌水洗下,，制成孢子懸液,。

（9）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤(rùn)濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻,。

（10）放入真空干燥器內(nèi),，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好,，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干,。

（11）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒,，接種于斜面培養(yǎng)基上,，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況和有無(wú)雜菌生長(zhǎng),，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長(zhǎng),，則說(shuō)明制作的沙土管有問(wèn)題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查,。

（12）若經(jīng)檢查沒(méi)有問(wèn)題,，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存,。每半年檢查一次活力和雜菌情況,。

（13）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí),，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi),，置溫箱中培養(yǎng)。

此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌,、放線菌，因此在抗生素工業(yè)中應(yīng)用zui廣,，效果亦好,，可保存2年左右，但應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳,。

5．液氮冷凍保藏法

（1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃的安瓿管,，安瓿管的大小通常使用75×10mm的,，或能容1．2mm液體的。

（2）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌,、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí),，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2,，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液,，加入量以能浸沒(méi)以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌15分鐘,。

（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管,；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器,，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi),，然后用火焰熔封,。浸入水中檢查有無(wú)漏洞。

（4）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃,。若細(xì)胞急劇冷凍,，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率,。

（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi),，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃,，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃,。

（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出,，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍,，直到全部融化為止。再打開(kāi)安瓿管,，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng),。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體,、衣原體,、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌,、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)期保藏,，而且性狀不變異,。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。

6．冷凍干燥保藏法

（1）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃,，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的,，亦稱淚滴型安瓿管，大小要求外徑6—7．5mm,，長(zhǎng)105mm,，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm,。也可用沒(méi)有球部的管狀安瓿管,。塞好棉塞，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,，備用。

（2）準(zhǔn)備菌種,，用冷凍干燥法保藏的菌種,，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò),，故所用菌種要特別注意其純度,，即不能有雜菌污染，然后在zui適培養(yǎng)基中用zui適溫度培養(yǎng),，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物,。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，若用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行保藏,，其存活率反而降低,。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物,；酵母需培養(yǎng)3天,；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天,。

（3）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例,，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液,，每支安瓿管分裝0．2ml,。

（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴,，此處介紹的是簡(jiǎn)易方法與裝置,，可達(dá)到同樣的目的。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,，無(wú)低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液,，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑,，只需冷凍4—5分鐘,，即可使懸液結(jié)冰。

（5）真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài),，需準(zhǔn)備冷凍槽,，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻,，可冷至-15℃,。

抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時(shí)，則干燥物不致熔化,，以后再繼續(xù)抽氣,，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥,，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg）,，保持壓力6—8小時(shí)即可。

（6）費(fèi)氏弧菌發(fā)光桿菌封口抽真空干燥后,，取出安瓿管,，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管繼續(xù)抽氣,，約10分鐘即可達(dá)到26．7Pa（0．2mmHg）,。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口,。封口以后,，保存于冰箱或室溫暗處。
堿性磷酸酶染液    500克    RT    進(jìn)口/國(guó)產(chǎn)
堿性磷酸酶測(cè)試盒    500支/包        *
堿性磷酸酶    100克        *
堿性蛋白酶    1克    2～8℃,，避光    進(jìn)口/國(guó)產(chǎn)
堿性蛋白胨水    100毫升        *
堿性膽鹽瓊脂    25克        *
堿性L-G培養(yǎng)基基礎(chǔ)    10克    保存：-20℃    *
堿式乙酸鉛    25克        *
堿式乙酸鋁    100克        *
堿式碳酸鋅    50毫升        *
堿式碳酸鎳    25克    RT    進(jìn)口/國(guó)產(chǎn)
堿式碳酸鎂    25克    RT    進(jìn)口/國(guó)產(chǎn)
費(fèi)氏弧菌發(fā)光桿菌