微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell 實驗）：應用微孔濾膜培養(yǎng)小室，進行膠質瘤細胞與內皮細胞的聯(lián)合培養(yǎng),，可以更接近體內環(huán)境,，模擬瘤細胞對血管內皮細胞的作用，濾膜上8μm的微孔可允許內皮細胞穿過到達膜的下面,，這些穿越遷移的內皮細胞可粘附于膜的下面,，通過計數(shù)濾膜下面的細胞可基本反映細胞的遷移情況。Transwell的基本原理是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,，小室內稱為上室,，培養(yǎng)板內稱為下室,，上室內添加上層培養(yǎng)液，下室內添加下層培養(yǎng)液,，上下層培養(yǎng)液以膜相隔,。將細胞種在上室內，由于膜有通透性,，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內的細胞,，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影,。選擇不同材料的膜和孔徑,，可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化,、細胞遷移,、細胞侵襲等多種方面的研究。

（一）實驗材料及試劑

24孔培養(yǎng)板,、Transwell小室,、倒置顯微鏡、酒精燈,、移液槍,、CO₂培養(yǎng)箱、細胞計數(shù)板等,；血清,、低血清DMEM培養(yǎng)液、多聚甲醛,、結晶紫,、PBS等。

（二）實驗內容

1,、分別取實驗分組的細胞種板前1天，血清饑餓12小時,，常規(guī)消化,、離心收集細胞，用低血清DMEM培養(yǎng)液（含0.2% FBS）混懸成密度為5×10⁵/ml的單細胞懸液,。

2,、將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，上室內加入100 μl細胞懸液（約5×10⁴細胞）,，下室內加入500 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,。

3、置于5% CO₂,，37℃孵箱培養(yǎng)24小時后,，PBS洗2次,，用棉球小心擦去上室內細胞，4%多聚甲醛固定20~30 min,，PBS洗2次,，0.1 %結晶紫染色30 min，PBS洗2次,，去掉多余染料,，顯微鏡下觀察拍照。

（三）注意事項

Transwell小室可重復利用多次,，但在棉簽擦拭的時候力度避免過大,，以免損傷小室膜；重復使用之前可觀察小室膜是否出現(xiàn)裂痕,，若出現(xiàn)較多裂痕可停止使用,。