一,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

 細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù),。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類,。本實驗室主要是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、miRcroRNA轉(zhuǎn)染,、慢病毒轉(zhuǎn)染,、藥物轉(zhuǎn)染、多肽轉(zhuǎn)染等,。

二,、miRcroRNA轉(zhuǎn)染

（一）實驗材料及試劑

        六孔板,、CO₂培養(yǎng)箱、EP管,、酒精燈等,；無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM,、RNA,、lipofectamine 2000、MSC細(xì)胞等,。

（二）實驗內(nèi)容

1當(dāng)六孔板中MSC細(xì)胞密度達(dá)90％時,，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，將無血清培養(yǎng)基,、MEM-α或DMEM取出復(fù)溫并注意平衡好,；

2取出細(xì)胞，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,，放回孵箱培養(yǎng),；

3取滅菌的EP管，按要求混好RNA（約100pmol/孔）,，每管250ul DMEM,，混勻；

4另取EP管,，加入lipofectamine 2000（5 ul/孔）和MEM-α或DMEM（250ul/孔）,，輕輕混勻后室溫靜置5min；

5將上述兩個EP管混勻,；

6室溫靜置20min,，將lipofectamine 2000-質(zhì)粒混合液滴到六孔板中,，500ul/孔,；

7將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng)，4h后換回含血清的*培養(yǎng)基,。

（三）注意事項

1轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素,。抗生素,，比如青霉素和鏈霉素,，一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。所以,，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。

2如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染,，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板,。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為0.5mL無血清培養(yǎng)基,。

3在37℃,，5％的CO₂中保溫24-48小時，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性,。