一,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

 細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA,，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù),。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類。本實(shí)驗(yàn)室主要是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,、miRcroRNA轉(zhuǎn)染,、慢病毒轉(zhuǎn)染、藥物轉(zhuǎn)染,、多肽轉(zhuǎn)染等,。

二、miRcroRNA轉(zhuǎn)染

（一）實(shí)驗(yàn)材料及試劑

        六孔板,、CO₂培養(yǎng)箱,、EP管、酒精燈等,；無血清培養(yǎng)基,、MEM-α或DMEM、RNA,、lipofectamine 2000,、MSC細(xì)胞等。

（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1當(dāng)六孔板中MSC細(xì)胞密度達(dá)90％時,，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染,，將無血清培養(yǎng)基,、MEM-α或DMEM取出復(fù)溫并注意平衡好；

2取出細(xì)胞,，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,，放回孵箱培養(yǎng)；

3取滅菌的EP管,，按要求混好RNA（約100pmol/孔），每管250ul DMEM,，混勻,；

4另取EP管，加入lipofectamine 2000（5 ul/孔）和MEM-α或DMEM（250ul/孔）,，輕輕混勻后室溫靜置5min,；

5將上述兩個EP管混勻；

6室溫靜置20min,，將lipofectamine 2000-質(zhì)?；旌弦旱蔚搅装逯校?00ul/孔,；

7將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng),，4h后換回含血清的*培養(yǎng)基。

（三）注意事項

1轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素,?？股兀热缜嗝顾睾玩溍顾?，一般對于真核細(xì)胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞,。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,。

2如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板,。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基,，替換為0.5mL無血清培養(yǎng)基。

3在37℃,，5％的CO₂中保溫24-48小時,，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。