流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

1。實(shí)驗(yàn)原理  

     用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,，通常用碘化丙啶（propidium iodide,，PI）染細(xì)胞核,。PI在一定波長(zhǎng)的光下發(fā)出熒光,，其強(qiáng)度與DNA含量成正比,。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析各時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù),，可檢測(cè)細(xì)胞的增殖,、凋亡,。

2,。流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞周期步驟  

     收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù),，以(1~5)×105/孔接種于6孔板，置37℃,，5％CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁,。次日更換培養(yǎng)液,，各孔分別加入含有0,、80,、400,、2000,、10000 mg/L不同濃度茶氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL/孔,，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng),；每24 h同法換液一次,。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù),。  48 h后,，中止培養(yǎng),，胰酶消化后,，收集細(xì)胞于流式管1000 r/min離心5min,，棄上,，冷PBS洗滌細(xì)胞3次,，離心去上清,；  一邊震蕩一邊向細(xì)胞沉淀中加入70%預(yù)冷乙醇混勻,，4℃固定18 h以上,；離心,，棄去乙醇上清,，加入預(yù)冷的PBS洗沉淀1次,，離心去上清,；  加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震蕩混勻,。室溫,、避光反應(yīng)30 min,；  流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測(cè)，用Modifit軟件分析各時(shí)相細(xì)胞周期的比例,。