人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉移模型的建立：（1）探討肺癌遠處轉移和阻斷其遠處轉移的研究,；（2）模擬晚期非小細胞肺癌轉移的自然發(fā)生過程,；（3）在活體動物的完整器官內評估瘤細胞播散和腫瘤的生長。

實驗方法原理         

將表達GFP的質粒pRNAT-U6/Neo轉染人肺腺癌細胞A549,，G418篩選獲得穩(wěn)定表達GFP細胞,，對比轉染前后細胞的生長活性和成瘤性。將轉染后細胞原位種植裸鼠預定標準處死,。HE染色和免疫組化檢測轉移灶的位置和數(shù)目,。利用KODAK  IS2000MM系統(tǒng)檢測腫瘤播散情況。

實驗材料         

BALB c nu nu裸鼠腺癌細胞株A549

試劑,、試劑盒        

小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA

儀器,、耗材     

熒光顯微鏡光學顯微鏡

實驗步驟     

一、實驗材料準備

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只,，雄性,，4-6周齡，體重18-20 g,，無特定病原體(SPF)級飼養(yǎng),。

2.  肺腺癌細胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibcobrl公司),，5% CO237℃培養(yǎng),，常規(guī)傳代。

3.  質粒和篩選藥物質粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司),，攜帶Neomycin耐藥基因供篩選,，在CMV啟動子控制下編碼cGFP作為轉染標記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選,。

二,、細胞的轉染

1.   哺乳動物磷酸鈣轉染系統(tǒng)(美國Promega公司)，按照操作指南將質粒pRNAT-U6/Neoo轉入A549細胞，轉染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉染效率,。

2.  后培養(yǎng)液內加G418篩選獲得穩(wěn)定轉染,。

3.  利用平板克隆形成試驗測定細胞克隆形成率>10%后，有限稀釋法獲得表達GFP陽性細胞,。

4.  1月后收獲轉染細胞,，常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加G418(200 μg/ml)維持篩選,。

5.  測定轉染后A549細胞增殖動力學指標,，對比轉染前后A549細胞生長曲線，檢測轉染后細胞的生長活性是否受轉染的影響,。

6.  待細胞增殖達一定數(shù)量后,，裸鼠皮下注射轉染前后細胞，記錄成瘤時間,，用公式V=1/2×長×寬 計算腫瘤體積,，對比轉染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。

三,、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立

1.  取轉染后細胞,，用不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)液沖洗2次并調整細胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。

2.  用0.5%的麻醉50 mg/kg)(中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠,，用26號針頭吸取細胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側胸腔，注射過程中注意控制刺入針頭的深度,。

3.  整個操作過程在細胞收獲后半小時內完成,，嚴格遵循無菌原則。

4.  注射后在KODAK IS2000MM下確認原位種植成功,，注射部位為胸腔,。

5.  注射后繼續(xù)飼養(yǎng)，隔天觀察一次并記錄體重,。

6.  當裸鼠出現(xiàn)精神萎靡,、呼吸短促、弓背并明顯消瘦,，體重較注射Et減輕20%時,，頸椎脫位術處死裸鼠。

7.  開胸觀察,，取出器官,，用10%甲醛固定保存。

四,、檢查項目

1.  轉染后細胞熒光顯微鏡成像轉染后24～48 h熒光顯微鏡下觀察,，確認轉染成功。單克隆化過程中鏡下觀察細胞克隆生長情況。

2.  活體GFP標記成像檢測應用KODAK IS2000MM進行活體熒光成像,，確認注射部位為胸腔,，后間斷應用以活體確認瘤細胞的遠處轉移。

3.  解剖學與組織學檢查處死的裸鼠均經(jīng)

詳細解剖學檢查,，取出器官,、固定包埋后，以4 tun厚度連續(xù)切片,，切片嚴格編號,，奇數(shù)號行HE染色，光鏡觀察,，以初步確定轉移灶。

4.  免疫組織化學染色

選擇肺臟,、肝臟和腦作為主要研究器官,，在HE染色確定轉移灶位置的基礎上，取相鄰偶數(shù)號碼的切片進行免疫組化檢測,，CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062),，LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000),、抗原修復液,、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

五,、統(tǒng)計學處理

細胞的生長活性和腫瘤體積x±s表示,，數(shù)值的比較采用方差分析。HE檢測結果和活體成像檢測結果的比較用x2檢驗,。采用SPSSl3．0軟件進行統(tǒng)計分析,。