ELISA實驗因靈敏度高,，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可，但對初學者而言,，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)，可能會對最終的實驗結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響,，比如實驗出現(xiàn)白板,，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現(xiàn)象,。下面對以上實驗現(xiàn)象進行一一解析,。

     1.白板現(xiàn)象
     在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中所有孔的顏色均為無色,，即無信號呈現(xiàn),。出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：試劑已過保質(zhì)期，不同批次稀釋液交叉使用,。錯加漏加檢測A,，檢測B或者底物溶液TMB。洗板或者加樣過程中,，酶標記物被污染失活,，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等,。配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。洗滌液是濃縮型的,，沒有按比例進行稀釋,。酶標記物的活性和效價比較低。溶液的PH值不正確,，一般稀釋液的PH值應保持在7.2-7.4,。
 
     2.顯色弱靈敏度低
     在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中孔的顯色比較淺,，即只有微弱的信號呈現(xiàn),。出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：產(chǎn)品過有效期，試劑沒有按規(guī)定進行適當?shù)谋４妗?/span>試劑,，標準品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫,。少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當。洗板或者加樣過程中,，酶標物受污染失活,。孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求,，洗板次數(shù)過多,，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長,。底物溶液TMB顯色時間太短,。
 
    3.花板無梯度背景高
    在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中的孔有顏色但沒有梯度,，背景也可能較高,，。出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存,，實驗前溶液已經(jīng)變藍,。孵育溫度過高或者孵育時間過長，發(fā)生了較強的非特異性吸附,。沒有按說明書要求洗板,，特別是洗板時洗滌液的量少加了。加樣時沒有換槍頭造成交叉污染,。花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體,，封閉不足導致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分,，包被板子的問題,。
 
    綜上所述：在ELISA實驗中應注意以下問題：
    1.在實驗前應該按相關(guān)要求將實驗試劑平衡至室溫。
    2.包被抗體和檢測抗體應該是有高活性的且都針對同一抗原,。
    3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度,，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度,。
    4.各試劑在使用前應充分混勻，以保證試劑的均一性和準確性,。
    5.嚴格控制反應溫度和反應試劑,。
    6.洗板次數(shù)，洗板液的量,，洗板液浸泡時間的長短,，洗板的力度都是應該注意的問題。
    7.相關(guān)濃縮液應按要求稀釋到相應比例方可使用,，PH值要保持在7.2-7.4之間,。
    8.在終止反應時盡量避免微孔中存有氣泡。

    9.終止反應完成后應該在2min內(nèi)完成酶標儀讀數(shù),。（轉(zhuǎn)載）