一、原理

      培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,，所以要進行細胞計數(shù),。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示,。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同,。

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞,，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力,，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用,。復(fù)蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果,。

      用臺盼蘭染細胞,，死細胞著色，活細胞不著色,，從而可以區(qū)分死細胞與活細胞,。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細胞相對數(shù)和相對活力,。

二,、儀器、用品與試劑

      1,、儀器與用品：普通顯微鏡,、血球計數(shù)板、試管,、吸管,、酶標儀（或分光光度計）

      2、試劑：0.4%臺盼蘭,，0.5%四甲基偶氮唑鹽（MTT）,、酸化異丙醇

      3、材料：細胞懸液

三,、操作步驟

（一）細胞計數(shù)

      1,、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上,。

      2,、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣,，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間,。

      3、靜置3分鐘,。

      4,、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù),，壓線細胞只計左側(cè)和上方的,。然后按下式計算：

      細胞數(shù)/ml=4大格細胞總數(shù)/ 4×10000

      注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團,，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上,，說明分散不好，需重新制備細胞懸液,。

（二）細胞活力

      1,、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

      2,、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液,，染色2一3分鐘。

      3,、吸取少許懸液涂于載玻片上,，加上蓋片。

      4,、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù),，計細胞活力。

      死細胞能被臺盼蘭染上色,，鏡下可見深蘭色的細胞,，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀,。

      活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行,，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測細胞相對數(shù)和相對活力

      活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細胞內(nèi)和細胞周圍,。其量與細胞數(shù)呈正比,，也與細胞活力呈正比。

      1,、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘,，棄上清液。

      2,、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成懸液,。

      3、37℃下保溫2小時,。

      4,、加入4-5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻,。

      5,、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色,，酸化異丙醇調(diào)零點,。

      注意：MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力,，不能測定細胞絕對數(shù)。

      附：1,、0.4%臺盼蘭染液配制：

      臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.

      2,、MTT配制：

      MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中,。4℃下保存,。

      3、酸化異丙醇配制：

      異丙醇中加入HCl使最終達0.04mol/L,。

此文轉(zhuǎn)載來源：丁香通