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中級(jí)會(huì)員 | 第6年

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PCR反應(yīng)混合物的分子實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟介紹

時(shí)間:2021/12/3閱讀:2347
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進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)需要先準(zhǔn)備PCR反應(yīng)混合物:根據(jù)DNA樣本的數(shù)量來(lái)確定除了DNA外其他混合物的體積(額外增加一份來(lái)確保有足夠的PCR反應(yīng)混合物),,將擴(kuò)增每一個(gè)遺傳標(biāo)記并且在每一個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)分19.5uL的反應(yīng)混合物,。
  配制膠溶液:將25g尿素、7.5mL40%丙烯酰胺:PDA(19:1)加入到250mL的錐形瓶中,。加蒸餾水至50mL,,充分混勻來(lái)溶解尿素(見注釋4)。
  準(zhǔn)備制膠板:把膠板洗干凈,,確保上面沒(méi)有灰塵,,用硅化玻璃板。根據(jù)各個(gè)廠家的不同把玻璃板夾在一起并且用膠條封住底部(這一過(guò)程根據(jù)設(shè)備的不同而有所變化),。
  如果不用帶有加熱蓋的PCR儀,,那么就需要在每個(gè)管子的頂部加入礦物油來(lái)防止液體蒸發(fā)。
  進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)在每個(gè)管子中加0.5的DNA樣本,。
  把管子放在PCR儀中,,95℃加熱3min變性DNA。
  95℃變性40s,、55℃引物退火40s,、72℃延伸40s,循環(huán)30-35次,。
  把PCR產(chǎn)物和尿素上樣緩沖液1:1混合.
  加入500uL10%的過(guò)硫酸銨到膠混合液中并且通過(guò)濾紙過(guò)濾,。
  取出10mL膠溶液加入到一個(gè)小燒杯中并且加10~15。馬上將膠倒到板上,。幾分鐘之內(nèi)膠將聚合到一起,,封玻璃板的底部。
  封好膠后,,加15ul到剩余的膠溶液中并且馬上把膠倒到兩塊膠板之間,。仔細(xì)插入膠梳子,,讓膠聚合2h至過(guò)夜,。
  取下膠底部的封條。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確,。將膠槽中灌滿(大約1.5L,,根據(jù)裝置的不同量有所不同)。拔掉膠梳子,,沖洗上樣孔,。
  把膠預(yù)熱60min直到溫度在50℃左右,。
  在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔。在每個(gè)孔中加產(chǎn)物和上樣染料(上樣量根據(jù)梳子的大小和PCR產(chǎn)物的濃度而不同),。根據(jù)產(chǎn)物片段大小的不同跑膠時(shí)間可以從30min到3h之間變化,。

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