關(guān)鍵詞:基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>慢病毒載體包含了包裝,、轉(zhuǎn)染,、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白,。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,，離心取得上清液后,，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,，整合到基因組,，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。
miRNA是一種21－25nt長的單鏈小分子RNA, 是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成,，miRNA具有高度的保守性,、時序性和組織特異性.而且這種特異性和時序性，決定了組織和細(xì)胞的功能特異性,，表明miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用,，因此miRNA的研究受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。
本中心可以將客戶研究的miRNA構(gòu)建到慢病毒載體,，生產(chǎn)的病毒顆?？梢灾苯佑糜诟腥炯?xì)胞或者動物實驗?？梢赃x擇將Pri-miRNA或者PremiRNA構(gòu)建到載體,，構(gòu)建中也可以根據(jù)實驗需要選用不同的Flank.
特點：
1．可以穩(wěn)定長期的表達(dá)miRNA，可以用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞模型用于長期的研究和觀察,。
2．感染效率高而且可以感染絕大部分細(xì)胞種類,。
3．可以直接用于動物實驗或者感染細(xì)胞后回輸?shù)絼游矬w內(nèi)。
1.將actin基因,，放入慢病毒融合表達(dá)載體,，與熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)，注意避免移碼突變,。
2.然后將重組質(zhì)粒以及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,，可以用脂質(zhì)體法，慢病毒配套細(xì)胞一般為293,。
3.收集慢病毒,，濃縮。
4.用慢病毒轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞,。做好先做預(yù)實驗,。
5.重組蛋白（例如，GFP-actin）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后,，自然的混入細(xì)胞骨架中,，將之標(biāo)記綠色熒光。
（一） 實驗流程（1和2為并列步驟）
1.慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設(shè)計上下游特異性擴(kuò)增引物,，同時引入酶切位點,，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體,。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu),，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為*培養(yǎng)基,，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,，病毒上清液通過超離心濃縮病毒,。
(二) 實驗材料
2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng),，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2,。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。
存在問題
首先,，重組病毒的滴度還不夠高,，除Naldini等報道的結(jié)果外，其余均在101TU/ml~103TU/ml之間,，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要;
其次,，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困難,，已建立的包裝細(xì)胞均不理想,。
更為謹(jǐn)慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建載體,，如猴免疫缺損病毒(SIV),、貓和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等,，而這些工作尚屬空白,。
