Western Blot|實驗技術(shù)服務(wù)

時間：2015/7/1閱讀：263

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簡介：世界*品牌Western Blot|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
Western Blot|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復(fù)實驗,。另一方面,，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>1. 組織塊稱重
2. 利用液氮,、研缽粉碎組織塊
3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA），PMSF（每克組織30μl,，10 mg/ml PMSF）,，利用Polytron進一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃
4. 加入PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF）,，冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度）,，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘
10. 上樣
11. 電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40分鐘）
13. 膜用麗春紅染色,，膠用考馬斯亮藍(lán)染色
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
western blot的實驗步驟及注意事項的資料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡,。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間,，保持濕潤和沒有氣泡,。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極,。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中,，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移,。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后,，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠,。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置,。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜,，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時,。
5. 室溫下,，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中,，盡可能不留空氣,。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊,。
8．混合：NGS(100微升),，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中,，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml,。
10．將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi),，于室溫下?lián)u動1小時。
11．按步驟9洗滌,。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）,，于室溫下?lián)u動。
注意事項：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),，空間結(jié)構(gòu)改變,，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶標(biāo)記親和素進行western blot,。實驗中取膠和膜需帶手套,。

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