關(guān)鍵詞:Western Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌Western Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*,。
Western Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí),，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌： http://www.,。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1. 組織塊稱重
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊
3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA）,，PMSF（每克組織30μl,，10 mg/ml PMSF），利用Polytron進(jìn)一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃
4. 加入PMSF（每克組織30μl,，10 mg/ml PMSF）,，冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘
10. 上樣
11. 電泳（濃縮膠20mA,，分離膠35mA）
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40分鐘）
13. 膜用麗春紅染色,，膠用考馬斯亮藍(lán)染色
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜,，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,，用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕）,，將凝膠夾在中間,，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,，凝膠面向陰極,。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠,。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移,。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠,，棄去凝膠,。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出,，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置,。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí),。
5. 室溫下,，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,，盡可能不留空氣,。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊,。
8．混合：NGS(100微升),，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中,，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml,。
10． 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi),，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
11． 按步驟9洗滌,。
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）,，于室溫下?lián)u動(dòng)。
注意事項(xiàng)：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),，空間結(jié)構(gòu)改變,，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化,，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot,。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。
