關(guān)鍵詞:SRB技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌SRB技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
SRB技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí),，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1.SRB檢測(cè)方法的原理
磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,，SRB)比色法，主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,。SRB是一種粉紅色陰離子染料,，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合;在540 nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰,，吸光值與細(xì)胞量成線性正相關(guān),，故可用作細(xì)胞數(shù)的定量檢測(cè)。SRB染色后不會(huì)像MTT法那樣很容易變色,，細(xì)胞固定染色后在96孔板中可以放置較長(zhǎng)時(shí)間,，因而受測(cè)定時(shí)間的影響較小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間,。因此不同時(shí)間點(diǎn)固定的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板可在同一時(shí)間測(cè)定,，測(cè)定的吸光值結(jié)果不會(huì)受到明顯影響,。吸光值與SRB濃度作圖時(shí),，在OD單位1.5-2.0以下為線性，當(dāng)超出線形范圍時(shí),，稀釋后重新讀數(shù),。雖然SRB法比其他檢測(cè)方法操作步驟繁瑣，但是由于時(shí)間可以自己掌握,，不受限制,，因此適用于高通量篩選。
2.SRB檢測(cè)的操作步驟
1)細(xì)胞固定:藥物作用時(shí)間終點(diǎn)時(shí),，每孔加入50μL4℃預(yù)冷的TCA溶液(30%,，w/v)固定細(xì)胞，TCA溶液的終濃度為10%,。靜置5 min移入4℃冰箱中固定1 h,，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾干,。
2)染色:待96孔板室溫下晾干后,，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液,，用1%(v/v)乙酸沖洗4次,，去除未結(jié)合的染料,，室溫晾干。
3)檢測(cè):用100μL非緩沖Tris-base堿液(10mM,，pH=10.5)溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料,，水平搖床上振蕩20min，采用酶標(biāo)儀540nm處測(cè)定光吸收值,。操作中,，應(yīng)注意洗除染料時(shí)操作需迅速，避免用移液器吸取液體,，防止動(dòng)作過(guò)慢造成與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料解吸附,。
3.SRB檢測(cè)的計(jì)算公式
根據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)關(guān)于SRB檢測(cè)的介紹,，細(xì)胞增殖百分率的計(jì)算存在以下兩種情況:1)Tx-T0>0,，PG=100×(Tx-T0)/(C-T0)
2)Tx-T0<0，PG=100×(Tx-T0)/T0
其中,，
T0:藥物作用前的細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定,、染色后測(cè)得平均吸光值;
C:培養(yǎng)基中加有等體積的DMSO，沒有藥物作用的陰性對(duì)照的平均吸光值(陰性對(duì)照);
Tx:藥物作用終點(diǎn)時(shí)細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定,、染色后測(cè)得平均吸光值,。
PG即Percentage Growth，是指藥物作用的樣品孔與陰性對(duì)照孔中細(xì)胞增殖量的百分率,。
1,， 根據(jù)水樣中 SRB 的估計(jì)濃度，可以選擇一組合適數(shù)目的細(xì)菌瓶,。首先將培養(yǎng)瓶排成 一組,，并依次編上序號(hào)。
2,， 將細(xì)菌瓶的瓶塞保護(hù)膜揭去,，并用 70%的乙醇溶液消毒。
3,， 按照準(zhǔn)備工作的第 3 條操作后,，用無(wú)菌注射器取 1ml 水樣，注入到一號(hào)瓶?jī)?nèi),，充分 震蕩,。
4， 用另一支無(wú)菌注射器從一號(hào)瓶?jī)?nèi)取 1ml 水樣,，注入到二號(hào)瓶?jī)?nèi),，充分震蕩。
5,， 再更換一支無(wú)菌注射器,，從二號(hào)瓶?jī)?nèi)取 1ml 水樣,，注入到三號(hào)瓶?jī)?nèi)，充分震蕩,。
6,， 依次類推，一直稀釋到zui后一瓶為止,。根據(jù)細(xì)菌含量確定稀釋瓶數(shù),，一般稀釋到 7 號(hào)瓶。
7,， 把上述測(cè)試瓶放入到恒溫培養(yǎng)箱中,， 培養(yǎng)溫度控制在現(xiàn)場(chǎng)水溫正負(fù) 1℃范圍內(nèi)，兩周 后讀數(shù),。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)細(xì)胞增殖活力或檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響
實(shí)驗(yàn)原理：磺酰羅丹明是一種能與生物大分子的堿性氨基酸結(jié)合的水溶性蛋白染料,，其結(jié)合于細(xì)胞中的量的多少可以反映總蛋白量進(jìn)而反映細(xì)胞數(shù)的多少。在515nm波長(zhǎng)處的OD值與活細(xì)胞數(shù)呈良好的線性
關(guān)系,。
實(shí)驗(yàn)材料： SRB（SIGMA）,，其它同MMT法
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法：
1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)、稀釋細(xì)胞懸液,，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,，培養(yǎng)；
2. 加入含藥培養(yǎng)基,，同時(shí)設(shè)立陰性,、溶媒及陽(yáng)性對(duì)照組，培養(yǎng),；
3. SRB染色,，測(cè)定；
4. 計(jì)數(shù)各組別抑制率及應(yīng)用SPSS 17.0通過(guò)Bliss法計(jì)算IC50.
