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Southern Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

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關(guān)鍵詞:Southern Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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測序?qū)嶒?yàn)流程:
一、 待測核酸樣品的制備
(一)制備待測DNA
基因組DNA是從動物組織(或)細(xì)胞制備,。1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞,,或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞;2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA;3.用有機(jī)試劑(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白質(zhì)。
(二) DNA限制酶消化
基因組DNA很長,,需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析,,通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子,,但有時為了某些特殊的目的,,分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定,有時可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段,。消化DNA后,,加入EDTA,65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進(jìn)行電泳分離,,必要時可進(jìn)行乙醇沉淀,,濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離。
二,、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品
(一)基本原理
Southern印跡雜交是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片段長短進(jìn)行分離,,然后進(jìn)行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小,。因此,制備DNA樣品后需要進(jìn)行電泳分離,。在恒定電壓下,,將DNA樣品放在0.8~1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70-80000bp的DNA片段,,故可對DNA片段進(jìn)行分離,。但需要用不同的膠濃度來分辨這個范圍內(nèi)的不同的DNA片段。原則是分辨大片段的DNA需要用濃度較低的膠,,分辨小片段的DNA則需要濃度較高的膠,。經(jīng)過一段時間電泳后,DNA按分子量大小在凝膠中形成許多條帶,,大小相同的分子處于同一條帶位置,。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小或是所處的分子大小范圍,往往同時在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA (DNA marker)進(jìn)行電泳,。DNA marker可以用放射性核素進(jìn)行末端標(biāo)記,,通過這種方式,雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶,。
(二) 基本步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠,,盡可能薄。DNA樣品與上樣緩沖液混勻,,上樣,。推薦使用的靶基因的上樣量見不同條件下上樣本的使用指針比較表。一般而言,,對雜交系統(tǒng),,所需DNA樣品的濃度較低,每道加2.5-5μg人類基因組DNA;如果基因組比人類DNA更復(fù)雜(如植物DNA)則上樣量可達(dá)10μg;每道上質(zhì)粒DNA<1ng,。
2. 分子質(zhì)量標(biāo)志物(DIG標(biāo)記)上樣,。
3. 電泳,,使DNA條帶很好的分離。不同條件下上樣本的使用指針比較表
不同條件下上樣本的使用指針比較表
4. 評價靶DNA的質(zhì)量,。在電泳結(jié)束后,,0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min,紫外燈下觀察凝膠,。

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