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DNA測序技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時(shí)間:2015/6/2閱讀:418
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測序?qū)嶒?yàn)流程:
DNA測序技術(shù),,即測定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學(xué)研究中,,DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ),。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等(1977)發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert(1977)發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大,,但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始,,隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止,產(chǎn)生 A,,T,,C,G四組不同長度的一系列核苷酸,,然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測,,從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應(yīng)用,。
該成果實(shí)現(xiàn)了與主流設(shè)備性能相當(dāng)?shù)膰a(chǎn)化DNA測序能力,,在基因組學(xué)、生物信息學(xué),,乃至生命科學(xué)諸多方向的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面具有重要實(shí)用價(jià)值,。
(1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配制。
(2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意,,把凝膠從超純水轉(zhuǎn)移到顯影溶液的總時(shí)間不能長于5-10秒,。浸泡時(shí)間過長則導(dǎo)致信號(hào)微弱或喪失信號(hào)。若浸泡時(shí)間過長,可重復(fù)第五步用染色液浸泡,。
(3). 立刻將凝膠轉(zhuǎn)移至1升(總量的一半)預(yù)冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)*批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續(xù)顯影2--3分鐘,或直至所有條帶出現(xiàn),。
6. 固定凝膠:在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應(yīng),固定凝膠,。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次,,每次2分鐘,注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋,。
8. 將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥,。在可見光燈箱或亮白,黃色背景(如紙)上觀察凝膠,,若需*保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
[注意] 測序產(chǎn)物的銀染是顯現(xiàn)序列信息的一種新方法,本系統(tǒng)的成敗受幾個(gè)因素的影響,。
1. 水的質(zhì)量對于染色的成功極其重要,。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質(zhì), 則低分子量條帶可能無法出現(xiàn)。
2. 碳酸鈉也非常重要,。使用新鮮的,,美國化學(xué)學(xué)會(huì)級(jí)碳酸鈉較好,如Fisher和Kodak ACS試劑級(jí)碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3,,或Kodak Cat #109-1990),,一般可獲得較好的結(jié)果。
3. 染色后的洗滌步驟是非常關(guān)鍵的,。如果凝膠洗滌時(shí)間太長,,銀顆粒會(huì)脫離DNA, 產(chǎn)生很少或沒有序列信號(hào)。如果洗滌時(shí)間過長,,染色步驟可以重新進(jìn)行,。
4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯酰胺濃度高于4-6%,則有必要延長固定和染色的時(shí)間,。如果凝膠比0.4mm薄,,染色反應(yīng)后的洗滌必須縮短至不超過5秒。
5. 在室溫下進(jìn)行所有步驟,,顯影反應(yīng)除外,。顯影溶液必須預(yù)冷至10-12℃以減小背景雜色。注意:臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉,。用新配的染色及顯影溶液,。不要重復(fù)使用任何溶液,。

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