關(guān)鍵詞:DNA測序服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌DNA測序服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*,。
DNA測序服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復(fù)實驗,。另一方面,，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>DNA測序技術(shù),，即測定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學(xué)研究中,，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ),。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等(1977)發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert(1977)發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大,，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始,，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A,，T,，C，G四組不同長度的一系列核苷酸,，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測,，從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應(yīng)用,。
該成果實現(xiàn)了與主流設(shè)備性能相當(dāng)?shù)膰a(chǎn)化DNA測序能力,，在基因組學(xué)、生物信息學(xué),，乃至生命科學(xué)諸多方向的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面具有重要實用價值,。
1. 對于每組測序反應(yīng)，標(biāo)記四個0.5ml eppendorf管(G,、A,、T、C),。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix),。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆谩?br>2. 對于每組四個測序反應(yīng),在一個eppendorf管中混合以下試劑:
(1) 樣品反應(yīng):
質(zhì)粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
(2)對照反應(yīng)
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml),。用吸液器吸動幾次混勻,。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內(nèi),。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部,。
6. 把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀,，以[注意]中循環(huán)模式為基準(zhǔn)，開始循環(huán)程序,。對于每個引物/模板組合都必須選擇*退火溫度,。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。
7. 熱循環(huán)程序完成后,，在每個小管內(nèi)加入3μl DNA測序終止溶液,，在微量離心機中略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng),。
[注意] 1,、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入:
模板種類/長度 模板量
200bp (PCR產(chǎn)物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp(超螺旋質(zhì)粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號比松弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質(zhì)粒作為模板時其用量要比其它模板大一些,。
2,、計算與4.5pmol相當(dāng)?shù)囊锛{克數(shù)可用以下一般公式:
4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數(shù)
計算與1pmol相當(dāng)?shù)囊镂⒖藬?shù)可用以下一般公式:
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數(shù)
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數(shù)
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物,， 熱循環(huán)儀必須預(yù)熱至95℃,。溫度變換應(yīng)越快越好。下面的循環(huán)時間不包括變溫時間,。如果你無法確定使用何種模式,，建議從模式1開始,。
模式1:適用于引物<24堿基或GC含量<50%
95℃ 2分鐘,。然后: 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鐘(延伸)
模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鐘, 然后: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸),。
