關(guān)鍵詞:多肽合成|實驗技術(shù)服務(wù)
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多肽合成|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>多肽是一種與生物體內(nèi)各種細胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間,，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱,，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究,、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
具體合成由下列幾個循環(huán)組成：
1） 去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團,。
2） 激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化,?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵,。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成,。
3） 洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來,，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護,。
試劑檢測：沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶,，也可以采用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。
固相多肽合成中,，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法,，其檢測結(jié)果，如果有游離氨基的時候,，顯示蘭色,，或紅褐色（pro,，ser，His）,。
Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液,；B,，80% 苯酚的乙醇溶液,；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后,，重蒸后再使用,。檢測過程,，取少量樹脂，加入A,，B，C各2-3滴,，100℃下加熱1-2min,，如果溶液有蘭色,，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色,，表明還有游離氨基,，否則說明連接*。
其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法,，苦味酸法，溴芬蘭法等.
氨基酸保護基
20種常見氨基酸,，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala,，Gly,，Val，Leu,，Ile,，）,，芳香族氨基酸（Phe，Tyr,，Trp，His）,，酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp,，Glu，Asn,，Gln）,，堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg）,，含硫氨基酸（Cys,，Met），含醇氨基酸（Ser,，Thr），亞氨型基酸（Pro）,。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護非常關(guān)鍵,，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵,。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的,，需要進行保護,，一般要求，這些保護基在合成過程中穩(wěn)定,，無副反應(yīng),，合成結(jié)束后可以*定量的脫除,。合成中需要進行保護的氨基酸包括：Cys，Asp,，Glu，His,，Lys,，Asn，Gln,，Arg，Ser,，Thr,，Trp，Tyr,。需要進行保護的基團：羥基，羧基,，巰基,，氨基，酰胺基,，胍基，吲哚,，咪唑等,。其中Trp也可以不保護，因為吲哚性質(zhì)比較穩(wěn)定,。當(dāng)然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護，象,，Asn,，Gln ,，Thr，Tyr,。
多肽縮合試劑
目前多肽合成中,，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應(yīng),，zui早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮,，對稱酸酐以及混合酸酐的方法,，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋,，以及反應(yīng)試劑危險以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來的縮合試劑取代,，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型,，鎓鹽型（Uronium）,。
液相多肽合成（solution phase synthesis）
液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大,，合成成本低的顯著優(yōu)點,，而且由于是在均相中進行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富,，象一些催化氫化，堿性水解等條件,，都可以使用,，這在固相中,，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因,，無法應(yīng)用,。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。
合成多肽分析鑒定方法
多肽的分析鑒定方法有多肽一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)鑒定,，多肽一級結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析,，氨基酸序列分析,。二級結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD）,，NMR，X-衍射等方法,。
純度分析
多肽的純度分析,，一般都采用HPLC進行分析，選擇RP-C18,，粒徑5μm，孔徑300A,，4.6×150mm,，流動相：A，0.1% TFA/H2O,；B，0.1% TFA/ACN,，洗脫梯度,，5%B--65%B，時間30min,。也有些多肽，特別是短肽,，由于親水性強,，在C18上保留很弱,，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個改變分析梯度,，可以將起始梯度改為2%,，等度或小梯度洗脫；另外一個方法是在流動相中加入強離子對試劑,，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。
