關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)純化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌蛋白質(zhì)純化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
蛋白質(zhì)純化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí)，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異,，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái),。每種蛋白間的大小,、形狀、電荷,、疏水性,、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白,。
(1) 根據(jù)分子大小不同的分離方法:透析和超過(guò)濾(利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì));密度梯度離心(蛋白質(zhì)在介質(zhì)中離心時(shí)質(zhì)量和密度較大的顆粒沉降較快);凝膠過(guò)濾(一種柱層析)
(2) 利用溶解度差別分離:(等電點(diǎn)沉淀法)由于蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零,，減少了分子間靜電斥力，因而容易聚集沉淀,，此時(shí)溶解度zui小);鹽溶與鹽析(利用一定濃度鹽溶液增大或減小蛋白質(zhì)的溶解度)
(3) 根據(jù)電荷不同的分離方法,，主要包括電泳和離子交換層析分離;
(4) 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離(利用顆粒吸附力的強(qiáng)弱不同達(dá)到分離目的)
(5) 根據(jù)配體特性的分離--親和層析(利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子能夠特異而非共價(jià)地結(jié)合這一生物性質(zhì))
(6) 低溫有機(jī)溶劑沉淀法: 用與水可混溶的有機(jī)溶劑,，甲醇，乙醇或丙酮,，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性,，應(yīng)在低溫下進(jìn)行,。
注意事項(xiàng):
在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化的時(shí)候，都要時(shí)刻注意維護(hù)它的穩(wěn)定性,，保護(hù)它的活性,，有一些通用的注意事項(xiàng)需要牢記，它們包括:
1,、操作盡可能置于冰上或者在冷庫(kù)內(nèi)進(jìn)行,。
2、不要太稀,，蛋白濃度維持在μg/mL~mg/mL,。
3、合適的pH,，除非是進(jìn)行聚焦層析,，所使用的緩沖溶液pH避免與pI相同,，防止蛋白質(zhì)的沉淀,。
4、使用蛋白酶抑制劑,，防止蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解;在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí),，加入DNA酶，降解DNA,，防止DNA對(duì)蛋白的污染,。
5、避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動(dòng),，以防蛋白質(zhì)的變性,。
6、緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,。
7,、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)(或β-巰基乙醇)，防止蛋白質(zhì)的氧化,。
8,、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑，防止重金屬對(duì)目標(biāo)蛋白的破壞,。
9,、使用滅菌溶液,，防止微生物生長(zhǎng)。
一,、電泳:
在克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)分析過(guò)程中,，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時(shí),，通常都不采用電泳的方法,。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化蛋白質(zhì),，常用下述方法進(jìn)行:①?gòu)碾娪竞蟮哪z上切下所需的相應(yīng)條帶,，將凝膠壓碎，用緩沖液浸泡,，使其中的蛋白質(zhì)擴(kuò)散出來(lái),，從而獲得純化的蛋白質(zhì)。此法簡(jiǎn)單但回收率低,。②將電泳后的凝膠用電洗脫的方法使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到溶液中,，從而達(dá)到純化的目的。此法快速,，回收率高,，但需要特殊的電泳裝置。
二,、色譜法:
色譜法(chromatography)是蛋白純化中zui常用的一種方法,，這種方法既可以制備大量的純化蛋白質(zhì)，又可以保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性,。色譜的種類很多,，可分為常規(guī)色譜和液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)。凝膠過(guò)濾色譜,、離子交換色譜,、親和色譜等均為常規(guī)色譜法。HPLC包括反相液相色譜(reversed-phase HPLC,RP-HPLC),、離子交換液相色譜(ion exchange HPLC)等,。根據(jù)目標(biāo)蛋白性質(zhì)的不同可選用相應(yīng)的色譜分離技術(shù)純化蛋白質(zhì)。
1.凝膠過(guò)濾色譜法
凝膠過(guò)濾色譜法(gel-filtration chromatography, GFC)又稱排阻色譜,。凝膠是一類具有三維空間結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀顆粒物質(zhì),，如瓊脂糖凝膠(sepharose)、葡聚糖凝膠(sephadex),，將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用于物質(zhì)的分離,。當(dāng)被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱時(shí)，大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部,，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動(dòng)和分配,，流經(jīng)的路途短,，可很快被洗脫出來(lái)，而小于凝膠孔徑的分子則進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,，在凝膠內(nèi)部穿行,，流經(jīng)的路程長(zhǎng)，移動(dòng)的速度慢,，zui后被洗脫出來(lái);分別收集不同時(shí)相的洗脫液,，即可得到純化的物質(zhì)。
GFC可在存在有多種離子,、去污劑,、尿素、鹽酸胍,、高或低離子強(qiáng)度,、常溫或低溫等多種條件下進(jìn)行，根據(jù)所分離物質(zhì)的性質(zhì)不同可選擇相應(yīng)的色譜條件,，從而獲得有生物學(xué)活性的純化的生物大分子,。
2.離子交換色譜法
離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的不同進(jìn)行分離的技術(shù),，通常包括吸附,、吸收、擴(kuò)散,、穿透,、靜電引力等復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程。自然界的包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物大分子都帶有電荷,，當(dāng)所需分離的物質(zhì)通過(guò)離子交換色譜柱時(shí),，由于所帶電荷,、分子量等不同,，有些被固定相靠靜電引力所吸附，未被吸附的物質(zhì)可被緩沖液首先洗脫出來(lái);被吸附的物質(zhì)由于所帶電荷多少不同,，對(duì)固定相的親和力大小也不同,，可被梯度離子緩沖液先后洗脫下來(lái)，使同一溶液中的不同物質(zhì)被分離,。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用于帶正電荷物質(zhì)的分離,，而陽(yáng)離子交換劑可用于帶負(fù)電荷物質(zhì)的分離。
3.親和色譜法
許多生物大分子物質(zhì)具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特征,，如酶與底物及輔助因子,、酶與抑制劑、抗原與抗體,、激素與受體,、核酸片段與其互補(bǔ)的核酸序列,、生物素與親合素等，分子間的這種結(jié)合能力叫作親和力,。
親和色譜法可在溫和條件下操作,，純化過(guò)程簡(jiǎn)單、快速,、分辨率高,，對(duì)分離含量極少且性質(zhì)不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)極為有效。但由于不是任何生物大分子之間均有特異的親和力,，而針對(duì)于某一種親和分子就需要制備專一的親和色譜柱,，因此親和色譜的應(yīng)用具有一定的局限性，主要由于蛋白質(zhì)尤其是酶,、抗原,、抗體的分離與純化。