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單克隆抗體制備|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時(shí)間:2015/5/15閱讀:299
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測序?qū)嶒?yàn)流程:
1,、免疫動物 免疫動物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過程,。 一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠,,按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官,,刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆,,使其活化、增殖,,并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞,。
2、細(xì)胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠,,無菌操作取出脾臟,,在平皿內(nèi)擠壓研磨,制備脾細(xì)胞懸液,。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合,,并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,,各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合,,形成雜交瘤細(xì)胞。
3,、選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞,,一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中,,未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,,不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,,但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,,并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性,,因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。
4,、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化 在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞,,只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞,,因此,必須進(jìn)行篩選和克隆化,。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),。采用靈敏、快速,、特異的免疫學(xué)方法,,篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞,并進(jìn)行克隆擴(kuò)增,。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型,、亞類、特異性,、親和力,、識別抗原的表位及其分子量后,及時(shí)進(jìn)行凍存,。
5,、單克隆抗體的大量制備 單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。
(1)體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠,,首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理,。1-2周后,腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞,。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖,,并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周,,可見小鼠腹部膨大,。用注射器抽取腹水,即可獲得大量單克隆抗體,。
(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),。在培養(yǎng)過程中,雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體,,收集培養(yǎng)上清液,,離心去除細(xì)胞及其碎片,即可獲得所需要的單克隆抗體,。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限,。近年來,各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn),,大大提高了抗體的生產(chǎn)量,。
雜交瘤細(xì)胞融合后,要進(jìn)行篩選后才能使用,。雜交瘤細(xì)胞分為兩次:一,、篩選出雜交瘤細(xì)胞;二,、在初選的雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜家瘤細(xì)胞,這兩次篩選的方法和原理各不相同,。

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