關(guān)鍵詞:TUNEL檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌TUNEL檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*。
TUNEL檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費,。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時,，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復(fù)實驗。另一方面,，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>器材與試劑
1,、器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng),、搖床、組化筆,、小型染色缸,、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜,、吸管,、各種規(guī)格的移液器及槍頭等。
2,、試劑：試劑盒含TdT 2×,、Biotinylated標(biāo)記的dUTP、標(biāo)記streptavidin的HRP,、SSC 20×,、Proteinase k、DAB 20×,、DAB底物Buffer 20×,、H2O2 20×；
自備試劑：
（1）1×PBS（pH 7.4,，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4）,，115℃×15 min；
（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水,，115 ℃×15 min,；
（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存,。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2,；
（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA,；
（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）；
（7）DAB工作液（臨用前配制,，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）
（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）,。
（9）另外，雙蒸水,、無菌0.85%NaCl,、二甲苯、梯度乙醇（100,、95,、85、70,、50%）,、蘇木素。
實驗步驟
1,、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次,；
2、水化：用梯度乙醇（100%×5 min,、100%×3 min,、95%×3 min、85%×3 min,、70%×3 min,、50%×3 min）；
3,、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min,；
4、固定：浸入4%多聚甲醛15 min,；
5,、浸洗：PBS 5 min×2次；
6,、細(xì)胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30） min RT,；
7、浸洗：PBS洗5 min,；
8,、固定： 浸入4%多聚甲醛5 min；
9,、浸洗：PBS 5 min×2次,；
10、平衡：加100 ul平衡液，濕盒平衡10（5~10） min,；
11,、制備TUNEL反應(yīng)混合液：處理組用1ul rTdT+1ul 生物素標(biāo)記的dUTP+98 ul平衡液混勻；而陰性對照組不加rTdT,，改為三蒸水,；陽性對照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min,，用去離子水沖洗4次,，PBS浸洗5 min，后面步驟從第10步開始,。
12,、標(biāo)記反應(yīng)：加100ul TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h,。
13、終止反應(yīng)：浸入2×SSC 15 min,；
14,、浸洗：PBS 5 min×3次；
15,、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min,；
16、浸洗：PBS 5 min×3次,；
17,、酶標(biāo)反應(yīng)：加100 ul streptavidin標(biāo)記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min；
18,、浸洗：PBS 5 min×3次,；
19、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右,，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時,。
20、用去離子水沖洗幾次,；
21,、用蘇木素復(fù)染，3 s左右后立即用自來水沖洗,。梯度酒精脫水（50,、70、85,、95,、100、100%各1 min）、二甲苯透明1 min×2次,、中性樹膠封片,。
22、加一滴PBS或甘油在視野下,，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計200~500個細(xì)胞）并拍照,。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小,，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮,、變圓,、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮,、邊緣化,，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）,。
注意事項:
1,、結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽性結(jié)果,；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反應(yīng)，進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。
2,、初次檢測細(xì)胞凋亡，設(shè)置陽性對照片,。
3,、血細(xì)胞含量高的組織，盡可能延長過氧化氫的滅活時間,。
4,、蘇木素的復(fù)染時間需要摸索。
5,、每片所加試劑可調(diào)整,，一般30~100 ul不等，但也要防止液體揮發(fā)而干片,，且反應(yīng)均在放置濕盒內(nèi),。
