關(guān)鍵詞:TUNEL檢測(cè)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌TUNEL檢測(cè)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*,。
TUNEL檢測(cè)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí)，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,，其原理是生物素biotinylate標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP,，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合,，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng),，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞,，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞,；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA斷裂,，因而沒(méi)有3‘-OH形成,，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋,、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè),。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià),，以及通過(guò)雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段,。
器材與試劑
1,、器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng),、搖床、組化筆,、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）,、塑料蓋玻片或封口膜,、吸管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等,。
2,、試劑：試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標(biāo)記的dUTP,、標(biāo)記streptavidin的HRP,、SSC 20×,、Proteinase k、DAB 20×,、DAB底物Buffer 20×,、H2O2 20×；
自備試劑：
（1）1×PBS（pH 7.4,，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min,；
（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min,；
（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存,。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；
（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA,；
（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）,；
（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）
（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）,。
（9）另外，雙蒸水,、無(wú)菌0.85%NaCl、二甲苯,、梯度乙醇（100、95,、85,、70,、50%）,、蘇木素,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次,；
2,、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min,、95%×3 min、85%×3 min,、70%×3 min,、50%×3 min）；
3,、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min,；
4、固定：浸入4%多聚甲醛15 min,；
5,、浸洗：PBS 5 min×2次；
6,、細(xì)胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30） min RT,；
7、浸洗：PBS洗5 min,；
8,、固定： 浸入4%多聚甲醛5 min；
9,、浸洗：PBS 5 min×2次,；
10、平衡：加100 ul平衡液,，濕盒平衡10（5~10） min,；
11、制備TUNEL反應(yīng)混合液：處理組用1ul rTdT+1ul 生物素標(biāo)記的dUTP+98 ul平衡液混勻,；而陰性對(duì)照組不加rTdT,，改為三蒸水；陽(yáng)性對(duì)照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min,，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min,，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min,，后面步驟從第10步開(kāi)始,。
12,、標(biāo)記反應(yīng)：加100ul TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h,。
13,、終止反應(yīng)：浸入2×SSC 15 min；
14,、浸洗：PBS 5 min×3次,；
15、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min,；
16,、浸洗：PBS 5 min×3次；
17,、酶標(biāo)反應(yīng)：加100 ul streptavidin標(biāo)記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min,；
18、浸洗：PBS 5 min×3次,；
19,、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時(shí),。
20,、用去離子水沖洗幾次；
21,、用蘇木素復(fù)染,，3 s左右后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水（50,、70,、85、95,、100、100%各1 min）,、二甲苯透明1 min×2次,、中性樹(shù)膠封片。
22,、加一滴PBS或甘油在視野下,，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小,，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體,，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮,、變圓,、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮,、邊緣化,，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）,。