關(guān)鍵詞:TUNEL檢測|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌TUNEL檢測|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
TUNEL檢測|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況,，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端,，并與連接辣根過氧化酶（HRP,，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合，后者又與POD底物H2O2,、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應,，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞,；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂,，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色,。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋,、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價,，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段,。
器材與試劑
1、器材：光學顯微鏡及其成像系統(tǒng),、搖床,、組化筆、小型染色缸,、濕盒（塑料飯盒與紗布）,、塑料蓋玻片或封口膜、吸管,、各種規(guī)格的移液器及槍頭等,。
2、試劑：試劑盒含TdT 2×,、Biotinylated標記的dUTP,、標記streptavidin的HRP、SSC 20×,、Proteinase k,、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×,、H2O2 20×,；
自備試劑：
（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4）,，115℃×15 min,；
（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min,；
（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多,，再放入4 ℃保存。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2,；
（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA,；
（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）；
（7）DAB工作液（臨用前配制,，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）
（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）,。
（9）另外，雙蒸水,、無菌0.85%NaCl,、二甲苯、梯度乙醇（100,、95,、85、70,、50%）,、蘇木素,。
實驗步驟
1、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次,；
2,、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min,、95%×3 min,、85%×3 min、70%×3 min,、50%×3 min）,；
3、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min,；
4,、固定：浸入4%多聚甲醛15 min；
5,、浸洗：PBS 5 min×2次,；
6、細胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30） min RT,；
7,、浸洗：PBS洗5 min；
8,、固定： 浸入4%多聚甲醛5 min,；
9、浸洗：PBS 5 min×2次,；
10,、平衡：加100 ul平衡液，濕盒平衡10（5~10） min,；
11,、制備TUNEL反應混合液：處理組用1ul rTdT+1ul 生物素標記的dUTP+98 ul平衡液混勻；而陰性對照組不加rTdT,，改為三蒸水,；陽性對照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min,，用去離子水沖洗4次,，PBS浸洗5 min，后面步驟從第10步開始,。
12,、標記反應：加100ul TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1 h。
13,、終止反應：浸入2×SSC 15 min,；
14、浸洗：PBS 5 min×3次,；
15,、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min；
16,、浸洗：PBS 5 min×3次；
17,、酶標反應：加100 ul streptavidin標記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min,；
18、浸洗：PBS 5 min×3次,；
19,、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時,。
20,、用去離子水沖洗幾次；
21,、用蘇木素復染,，3 s左右后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水（50,、70,、85、95,、100,、100%各1 min）、二甲苯透明1 min×2次,、中性樹膠封片,。
22、加一滴PBS或甘油在視野下,，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照,。可結(jié)合凋亡細胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細胞變小,，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細胞出現(xiàn)鄒縮,、變圓,、脫落；而染色細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化,，核膜裂解,，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）。