人αL巖藻糖苷酶（AFU）ELISA試劑盒
人αL巖藻糖苷酶（AFU）ELISA試劑盒說明書
人αL巖藻糖苷酶（AFU）ELISA試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中αL巖藻糖苷酶（AFU）含量,。
實(shí)驗(yàn)原理:用純化的AFU抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的AFU抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的AFU呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。
人αL巖藻糖苷酶（AFU）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1,、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為100 U/L,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成100 U/L,，50 U/L,，25 U/L，12.5 U/L,，6.25 U/L,，3.12 U/L，1.56 U/L,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L,。如配制50 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）100 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3、 樣品稀釋液：1×20ml,。
4,、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5,、 檢測稀釋液B：1×10ml,。
6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100 /孔）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml,。
7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8,、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9,、 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10,、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）,。
11,、覆膜：5張
12、使用說明書：1份
自備物品:
1,、 蒸餾水或去離子水,，濾紙
2、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
3,、 微量加液器及吸頭,，EP管
標(biāo)本的采集及保存:
1、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2、 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3,、 其它生物標(biāo)本：請1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存,，4 保存應(yīng)小于1周,，-20 不應(yīng)超過1個月，-80 不應(yīng)超過2個月,；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時,，均需充分混勻,，混勻時盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
1,、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液 100 ,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 ,，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37 溫育2小時,。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效
性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2,、 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜,，37 溫育1小時,。
3、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘,，大約400 /每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4,、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ,，加上覆膜，37 溫育1小時,。
5,、 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ,，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯時,，即可終止）。
7,、 每孔加終止溶液50 ,，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物 液的加入順序相同,。
8、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）,。
注：
1,、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。
2,、 加樣：加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
3,、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài),；同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度,。
4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù),。
5,、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10 ）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液。
6,、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘），如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7,、 底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。
2.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,，在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
計算:各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖（七點(diǎn)圖）,，如設(shè)置復(fù)孔,，則應(yīng)取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品OD值,，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。
說明 :
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2. 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果,。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn),。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
6. 中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期：6個月
9.本試劑盒可同時檢測重組或天然的人AFU,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
