人維生素EELISA試劑盒
人維生素EELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
人維生素EELISA試劑盒僅供研究使用,，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn),。
檢測(cè)原理：：采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人維生素E（VE）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人維生素E（VE）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度,。
樣品收集、處理及保存方法：
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。
2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。
3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品：
1. 37℃恒溫箱
2. 酶標(biāo)儀（450nm）
3. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
操作注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對(duì)照或者空白；預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋?zhuān)苯尤?0μL加樣即可,。
4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑的準(zhǔn)備：20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20稀釋?zhuān)?份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。
洗板方法：
1. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5次,。
操作步驟：
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3. 待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；
4. 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。
結(jié)果判斷：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn),，按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本濃度值。
試劑盒性能：
1. 準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900,。
2. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度：zui低檢測(cè)濃度小于1.0 pmol/mL,。
4. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏：2-8℃,，避光防潮保存,。
6. 有效期：6個(gè)月
