人G蛋白偶聯(lián)受體109A（GPR109A）ELISA試劑盒
人G蛋白偶聯(lián)受體109A（GPR109A）ELISA試劑盒說明書
人G蛋白偶聯(lián)受體109A（GPR109A）ELISA試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清,、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中GPR109A含量,。
實驗原理:用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體，往包被抗GPR109A抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗GPR109A抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GPR109A呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。
說明:
1.試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。
2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3.中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
組成及試劑配制:
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。
5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120ul/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120ul/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
需要而未提供的試劑和器材
1.電熱恒溫培養(yǎng)箱
2.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
3.高速離心機
4.干凈的試管和Eppendof管
5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.蒸餾水,，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存:
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,。
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過程中,，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度時,，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為2000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋2000 pg/ml,，1000 pg/ml,，500 pg/ml，250 pg/ml,，125 pg/ml,，62 pg/ml，31 pg/ml,，15.6 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制1000 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）2000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10ul生物素標(biāo)記抗體加990ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
操作步驟:實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2.棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100ul（取1ul生物素標(biāo)記抗體加99ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干,。
4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100ul,，37℃，60分鐘,。
5.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干,。
6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。
7.依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測,。
注：
1.用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。
2.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3.為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,。
5.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
計算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
注意事項
1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡。
2.洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
3.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。
5.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
6.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。
7.底物請避光保存。
8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人GPR109A,，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
有效期：6個月
