人基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A（MMP-2/Gelatinase A）ELISA試劑盒
人基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A（MMP-2/Gelatinase A）ELISA試劑盒說明書
人基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A（MMP-2/Gelatinase A）ELISA試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
檢測范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml
zui低檢測限：0.078 ng/ml
實驗原理:用純化的MMP-2抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的MMP-2抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-2呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中MMP-2含量,。
組成及試劑配制:
1.酶標板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為20 ng/ml,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成20 ng/ml,，10 ng/ml,，5 ng/ml，2.5 ng/ml,，1.25 ng/ml,，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml,。如配制10 ng/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）20 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml。
4.檢測稀釋液A：1×10ml。
5.檢測稀釋液B：1×10ml,。
6.檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔）,，實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。
7.檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
8.底物溶液：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）,。
11.覆膜：5張
12.使用說明書：1份
自備物品:
1.蒸餾水或去離子水，濾紙
2.酶標儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
3.微量加液器及吸頭,，EP管
標本的采集及保存:
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.其它生物標本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
4.樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋100倍，如：稀釋100倍,，取10uL血清或血漿加入990uL樣品稀釋液,。標本使用0.1 M的PBS稀釋（ PH=7.0-7.2）。
注：以上標本均應(yīng)密封保存,，4保存應(yīng)小于1周,，-20不應(yīng)超過1個月，-80不應(yīng)超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟:實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,，試劑不能直接在37 溶解,；試劑或樣品配制時，均需充分混勻,，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
1.加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00，余孔分別加標準品或待測樣品100,，注意不要有氣泡,，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37溫育2小時,。為保證實驗結(jié)果有效
性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100（臨用前配制）,，酶標板加上覆膜,，37溫育1小時。
3.棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘,，大約400/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100,，加上覆膜,，37溫育1小時,。
5.棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液90,，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘,，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時,，即可終止）,。
7.每孔加終止溶液50，終止反應(yīng),，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物 液的加入順序相同。
8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）,。
注：
1.試劑準備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。
2.加樣：加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3.溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài),；同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4.洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。請 配制標準品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ）,，以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液,。
6.反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘）,，如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。
7.底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
2.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人MMP-2,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
計算:各標準品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔,，則應(yīng)取其平均值計算,。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），OD值為橫坐標（對數(shù)坐標）,，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3,，根據(jù)樣品OD值,，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。繪制標準曲線請取用以下濃度值：20 ng/ml，10 ng/ml,，5 ng/ml,，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml,，0.625 ng/ml,，0.312 ng/ml。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性,。而且，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準,。
4.濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
6.中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。
7.所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8.有效期：6個月
