人羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析試劑盒
人羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書
人羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：156 ng/ml - 10000 ng/ml
zui低檢測限：39 ng/ml
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中Hyp含量。
概述:羥脯氨酸（hydroxyproline）,，是亞氨基酸之一,，通常在第四位上帶有羥基，但有時也在第3位上,。由于有兩個不對稱的碳原子,，所以有4種立體異構(gòu)體。自然界中不存在D-羥脯酸,。在動物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸,。L-別羥脯氨酸是從鬼筆鵝膏（Amanita Phalloides）中得到的有毒的多肽鬼筆環(huán)肽（phalloidine）的組成成分。一般的蛋白質(zhì)不存在這種氨基酸,。在自然界的羥脯氨酸的甲基衍生物中有左旋水蘇堿,、右旋水蘇堿和γ-羥古液酸。在生物體內(nèi)羥脯氨酸是由脯氨酸合成的,但不是以游離狀態(tài),而是在肽鏈中被羥基化,。它的分解作用類似脯氨酸,，但以帶著羥基的狀態(tài)進(jìn)行,所以成為4-羥基谷氨酸。
實驗原理:用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被抗Hyp抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Hyp抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的Hyp呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。
組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2.標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）,。
3.樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。
4.生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶,。
6.生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
需要而未提供的試劑和器材:
1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.高速離心機(jī)
3.電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.干凈的試管和Eppendof管
5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器
6.蒸餾水,，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存:
1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注:標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測,。
標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時,，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10000 ng/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋10000 ng/ml,，5000 ng/ml,，2500 ng/ml，1250 ng/ml,，625 ng/ml,，312 ng/ml，156 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10000 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟:實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2.棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。
4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl,，37℃，60分鐘,。
5.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干,。
6.依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測,。
注：
1.用戶在初次使用試劑盒時,，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。
2.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。
4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,。
5.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
計算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
說明:
1.試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。
2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
3.中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
注意事項:
1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡,。
2.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
3.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。
4.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。
5.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。
7.底物請避光保存,。
8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人Hyp，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
有效期：6個月
