人羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析試劑盒
人羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
人羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析試劑盒僅供研究使用
檢測(cè)范圍：156 ng/ml - 10000 ng/ml
zui低檢測(cè)限：39 ng/ml
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中Hyp含量,。
概述:羥脯氨酸（hydroxyproline）,，是亞氨基酸之一,，通常在第四位上帶有羥基，但有時(shí)也在第3位上,。由于有兩個(gè)不對(duì)稱的碳原子,，所以有4種立體異構(gòu)體。自然界中不存在D-羥脯酸,。在動(dòng)物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸,。L-別羥脯氨酸是從鬼筆鵝膏（Amanita Phalloides）中得到的有毒的多肽鬼筆環(huán)肽（phalloidine）的組成成分。一般的蛋白質(zhì)不存在這種氨基酸,。在自然界的羥脯氨酸的甲基衍生物中有左旋水蘇堿,、右旋水蘇堿和γ-羥古液酸,。在生物體內(nèi)羥脯氨酸是由脯氨酸合成的,但不是以游離狀態(tài),而是在肽鏈中被羥基化。它的分解作用類似脯氨酸,，但以帶著羥基的狀態(tài)進(jìn)行,所以成為4-羥基谷氨酸,。
實(shí)驗(yàn)原理:用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗Hyp抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗Hyp抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的Hyp呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度,。
組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。
2.標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3.樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。
4.生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。
5.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6.生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
需要而未提供的試劑和器材:
1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.高速離心機(jī)
3.電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.干凈的試管和Eppendof管
5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
6.蒸餾水,，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存:
1.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
標(biāo)本的稀釋原則：首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過(guò)程中,，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí),，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為10000 ng/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋10000 ng/ml,，5000 ng/ml,，2500 ng/ml，1250 ng/ml,，625 ng/ml,，312 ng/ml，156 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10000 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
操作步驟:實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí),，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍,。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2.棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干。
4.每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃,，60分鐘,。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。
6.依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),。
注：
1.用戶在初次使用試劑盒時(shí),，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。
2.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。
3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。
4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
5.建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法:
1.自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。
計(jì)算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。
說(shuō)明:
1.試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）,；2-8℃（頻繁使用時(shí)）,。
2.濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
3.中,、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。
4.剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
注意事項(xiàng):
1.當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡,。
2.洗滌過(guò)程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3.一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。
5.如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù),。
6.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。
7.底物請(qǐng)避光保存。
8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。
特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人Hyp,，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
有效期：6個(gè)月
