人丙酮酸脫氫酶E1（PDH E1）ELISA試劑盒
人丙酮酸脫氫酶E1（PDH E1）ELISA試劑盒使用說明書
人丙酮酸脫氫酶E1（PDH E1）ELISA試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中丙酮酸脫氫酶-E1含量,。
實(shí)驗(yàn)原理:本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中丙酮酸脫氫酶-E1水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入丙酮酸脫氫酶-E1抗原,、生物素化的抗人丙酮酸脫氫酶-E1抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的丙酮酸脫氫酶-E1呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。
組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100 nmol/L,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成100 nmol/L，50 nmol/L ,，25 nmol/L,，12.5 nmol/L，6.25 nmol/L,，3.12 nmol/L,，1.56 nmol/L，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 nmol/L,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制50 nmol/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 100 nmol/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
2.樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
3.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
4.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
5.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
6.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
7.底物溶液：1×10ml/瓶。
8.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
9.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存:
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2.棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干,。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。
5.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干,。
6.依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。
7.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。
注：
1.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。
2.為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。
3.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
4.建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
計(jì)算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。
注意事項(xiàng):
1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2.一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。
3.請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。
4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時(shí),，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。
6.底物請避光保存,。
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人丙酮酸脫氫酶-E1，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2.小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4.濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
6.中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準(zhǔn)。
7.所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8.有效期：6個(gè)月
