人活化蛋白C（APC）ELISA試劑盒使用說明書
人活化蛋白C（APC）ELISA試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：156 pg/ml -10,00 pg/ml
預期應用:ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關液體中活化蛋白C（APC）含量。
實驗原理:本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中活化蛋白C水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被抗體的微孔中依次加入活化蛋白C,、生物素化的抗人活化蛋白C抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的活化蛋白C呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。
人活化蛋白C（APC）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10,000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10,000 pg/mL,，5,000 pg/mL ,，2,500 pg/mL，1,250 pg/mL,，625 pg/mL，312 pg/mL,，156 pg/mL,，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制5,000 pg/mL標準品：取0.5ml 10,000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
4.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
標本的采集及保存:
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃保存,，但應避免反復凍融,。
2.血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?20℃保存,，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
操作步驟:
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘,。
為保證實驗結果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。
3.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干,。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃,，60分鐘,。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注：
1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
2.為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,。
3.未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
4.建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性,。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次,。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人活化蛋白C,，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算:以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
注意事項:
1.洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
3.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。
4.如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
5.在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆,。
6.底物請避光保存。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果,。
2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本/標準品，酶結合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的“預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗結果。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標簽上的標示為準。
4.濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響,。
6.中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。
7.所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8.有效期：6個月
