人血小板活化因子（PAF）ELISA試劑盒說明書
人血小板活化因子（PAF）ELISA試劑盒只能用于科學研究,，不得用于醫(yī)學診斷
檢測原理:試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被血小板活化因子（PAF）抗體的包被微孔中，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的血小板活化因子（PAF）呈正相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣品收集,、處理及保存方法:
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
自備物品
1.37℃恒溫箱
2.酶標儀（450nm）
3.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
操作注意事項:
1.試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
2.實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。
3.濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，zui終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度,。
4.嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作。
5.所有液體組分使用前充分搖勻,。
人血小板活化因子（PAF）ELISA試劑盒組成:
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0,、1.5、3,、6,、12、24 ng/mL
試劑的準備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1:20稀釋,，即1 份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。
洗板方法:
1.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。
2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min 后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5次,。
操作步驟:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
3.樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；空白孔不加,。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
6.每孔加入底物A,、B 各50μL,，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL,，15min 內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。
繪制標準曲線：在Excel工作表中,，以標準品濃度作橫坐標,，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值,。
試劑盒性能:
1.準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R 值，大于等于0.9900,。
2.靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL,。
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。
4.重復性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。
5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。
6.有效期：6 個月
