人干擾素a抗體（IFN-a Ab）ELISA試劑盒說明書
人干擾素a抗體（IFN-a Ab）ELISA試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：15.6 U/mL -1000 U/mL
實(shí)驗(yàn)原理:本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中IFN-a Ab水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入IFN-a Ab抗原、生物素化的抗人IFN-a Ab抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IFN-a Ab呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人IFN-a Ab，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中IFN-a Ab含量,。
人干擾素a抗體（IFN-a Ab）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為1000 U/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1000 U/mL,，500 U/mL ,，250 U/mL，125 U/mL,，62.5 U/mL,，31.25 U/mL，15.6 U/mL,，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 U/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制500 U/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 1000 U/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
4.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
標(biāo)本的采集及保存:
1細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。
操作步驟:
各試劑在使用前平衡至室溫。實(shí)驗(yàn)開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時,，應(yīng)在試管中將樣品用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2.棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。
5.溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
6.依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)）（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。
7.依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測,。
注：
1.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2.為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
3.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，不要一次用完。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
4.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
計(jì)算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。
注意事項(xiàng)
1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。
3.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。
4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計(jì)算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。
6.底物請避光保存,。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2.小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果,。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn),。
4.濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
6.中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。
7.所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8.有效期：6個月
