人胰脂肪酶（PL）ELISA試劑盒使用說明書
人胰脂肪酶（PL）ELISA試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!
檢測范圍： 4.69 U/L - 300 U/L，繪制標準曲線請取用以下濃度值：300 U/L,，150 U/L,，75 U/L，37.5 U/L,，18.75 U/L,，9.38 U/L,，4.69 U/L。
zui低檢測限：1.17 U/L
實驗原理:用純化的PL抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的PL抗體,、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的PL呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人PL，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應,。
預期應用:ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中PL含量。
人胰脂肪酶（PL）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶標板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為600 U/L，將其稀釋為300 U/L后,，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別配制成300 U/L，150 U/L,，75 U/L,，37.5 U/L，18.75 U/L,，9.38 U/L,，4.69 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L,。如配制150 U/L標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）300 U/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml,。
4.檢測稀釋液A：1×10ml。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml,。
6.檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如:10檢測溶液A/990檢測稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100/孔）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。
7.檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11.覆膜：5張
12.使用說明書：1份
自備物品:
1.蒸餾水或去離子水,，濾紙
2.酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）
3.微量加液器及吸頭,，EP管
標本的采集及保存:
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應避免反復凍融,。
2.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應避免反復凍融,。
3.其它生物標本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應避免反復凍融,。
4.保存：密封保存,；保存應小于1周，-20 不應超過1個月,，-80 不應超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
操作步驟:實驗開始前,，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37溶解,；試劑或樣品配制時,，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應預測樣品含量,，如樣品濃度過高時,，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù),。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100,，余孔分別加標準品或待測樣品100,，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37 溫育2小時,。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2.棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液100（臨用前配制）,，酶標板加上覆膜，37溫育1小時,。
3.棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4.每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100,，加上覆膜，37溫育1小時,。
5.棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，方法同步驟3,。
6.每孔加底物溶液90，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯時,，即可終止）。
7.每孔加終止溶液50,，終止反應,，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。
8. 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）,。
注：
1.試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。
2.加樣：加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的 “預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),。推薦設置復孔進行實驗。
3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā),實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作,，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)；同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度,。
4.洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆,。請 配制標準品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10）,，以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差,；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液,。
6.反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘），如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
2.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次,。
計算:各標準品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖（七點圖），如設置復孔,，則 應取其平均值計算,。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），OD值為橫坐標（對數(shù)坐標）,，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品OD值,，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本/標準品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的“預孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標簽上的標示為準,。
4.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
6.中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。
7.所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8.有效期：6個月
