人胰脂肪酶（PL）ELISA試劑盒使用說明書
人胰脂肪酶（PL）ELISA試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!
檢測范圍： 4.69 U/L - 300 U/L，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請取用以下濃度值：300 U/L,，150 U/L，75 U/L，37.5 U/L,，18.75 U/L，9.38 U/L,，4.69 U/L,。
zui低檢測限：1.17 U/L
實(shí)驗(yàn)原理:用純化的PL抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的PL抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的PL呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人PL,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中PL含量,。
人胰脂肪酶（PL）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為600 U/L,，將其稀釋為300 U/L后,，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成300 U/L,，150 U/L,，75 U/L，37.5 U/L,，18.75 U/L,，9.38 U/L，4.69 U/L,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L,。如配制150 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）300 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml。
4.檢測稀釋液A：1×10ml,。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml,。
6.檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如:10檢測溶液A/990檢測稀釋液A）,，充分混勻,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。
7.檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）,。
11.覆膜：5張
12.使用說明書：1份
自備物品:
1.蒸餾水或去離子水，濾紙
2.酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
3.微量加液器及吸頭,，EP管
標(biāo)本的采集及保存:
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.其它生物標(biāo)本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
4.保存：密封保存；保存應(yīng)小于1周,，-20 不應(yīng)超過1個(gè)月,，-80 不應(yīng)超過2個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
操作步驟:實(shí)驗(yàn)開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時(shí),，均需充分混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,，如樣品濃度過高時(shí),，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
1.加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100,，注意不要有氣泡,，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時(shí),。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.棄去液體,，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液100（臨用前配制）,，酶標(biāo)板加上覆膜，37溫育1小時(shí)。
3.棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4.每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100,，加上覆膜,，37溫育1小時(shí),。
5.棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次,，方法同步驟3,。
6.每孔加底物溶液90,，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘,，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯時(shí),，即可終止）。
7.每孔加終止溶液50,，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。
8. 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）,。
注：
1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。
2.加樣：加樣或加試劑時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā),實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度,。
4.洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù),。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時(shí),，一次不要小于10）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液。
6.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘）,，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。
7.底物：底物請避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。
洗板方法:
1.自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。
2.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
計(jì)算:各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔,，則 應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品OD值,，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。
說明:
1.在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
2.小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度,。請注意在吸取標(biāo)本/標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果,。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
6.中,、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,，請以英文說明書為準(zhǔn)。
7.所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8.有效期：6個(gè)月
