人高密度脂蛋白（HDL）ELISA試劑盒使用說明書
人高密度脂蛋白（HDL）ELISA試劑盒僅供體外研究使用
檢測范圍：1.56 ng/ml - 100 ng/ml
zui低檢測限：0.39 ng/ml
實驗原理:用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗HDL抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗HDL抗體、HRP標記的親和素,，經過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HDL呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。
預期應用:ELISA法定量測定人血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中高密度脂蛋白（HDL）含量。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人高密度脂蛋白（HDL）,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。
人高密度脂蛋白（HDL）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100 ng/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋100 ng/ml，50 ng/ml,，25 ng/ml,，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml,，3.12 ng/ml,，1.56 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內配制,。如配制50 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）100 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
5.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制,。
7.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
標本的采集及保存:
1.血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
3.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
4.樣本處理:血清或血漿標本推薦稀釋10000倍,。
5.保存：標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存,，-20℃不應超過3個月,，-80℃不應超過6個月；標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測,。
操作步驟:實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭辉噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,，均應用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。建議各實驗室在操作前**行預實驗以建立*稀釋倍數,。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2.棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內配制）,，37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,，棄去孔內液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）,。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃，60分鐘,。
5.溫育60分鐘后,，棄去孔內液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）,。
6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內,，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。
7.依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應,，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進行檢測,。
注：
1.每次實驗留一孔作為空白調零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調OD值至零。
2.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果,。所有試劑都必須在使用前達到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑。
3.洗板不正確可以導致不準確的結果,。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內液體,。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,，酶標板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作,，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài),。
4.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。
5.在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
6.未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用,，請配置標準品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul）,，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；檢測液A、B,，以及底物溶液在使用前,，應置于37℃溫育30分鐘；請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
7.建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法:
1.自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,根據需要,重復此過程數次,。
計算:以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curve expert 1.3），根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數,，即為樣品的實際濃度,。
注意事項:
1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣,。
3.請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔。
4.如標本中待測物質含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5.在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。
6.底物請避光保存,。
說明:
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果。
2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本/標準品,，酶結合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。而且，洗滌不充分將影響試驗結果,。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準,。
4.濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響,。
6.中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。
7.所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8.有效期：6個月
