人熱休克蛋白70（HSP-70）ELISA試劑盒使用說明書
人熱休克蛋白70（HSP-70）ELISA試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!
檢測范圍:0.156ng/ml - 10 ng/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值:10ng/ml,，5ng/ml,，2.5ng/ml,，1.25ng/ml，0.625ng/ml,，0.312ng/ml,，0.156ng/ml。
zui低檢測限：0.039 ng/ml
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人HSP-70,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中HSP-70含量,。
實驗原理:用純化的HSP-70抗體包被微孔板,，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的HSP-70抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HSP-70呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ 值）,，計算樣品濃度。
人熱休克蛋白70（HSP-70）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶標板:一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）:2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10ng/ml,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別配制成10ng/ml,，5ng/ml，2.5ng/ml,，1.25ng/ml,，0.625ng/ml，0.312ng/ml,，0.156ng/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/ml。如配制5ng/ml標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml）10 ng/ml的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml,。
4.檢測稀釋液A:1×10ml,。
5.檢測稀釋液B:1×10ml。
6.檢測溶液A:1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A/990 檢測稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100/孔）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。
7.檢測溶液B:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液:1×10ml/瓶（2mol/LH2SO4）。
11.覆膜:5張
12.使用說明書:1份
自備物品:
1.酶標儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
2.微量加液器及吸頭,，EP管
3.蒸餾水或去離子水,，濾紙
標本的采集及保存:
1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于1000 g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.其它生物標本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注:以上標本均應(yīng)密封保存，4 保存應(yīng)小于1周,，-20 不應(yīng)超過1個月,，-80 不應(yīng)超過2個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
操作步驟:
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時,，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量,，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣:分別設(shè)空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00,，余孔分別加標準品或待測樣品100，注意不要有氣泡,，加樣 時將樣品加于酶標板底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效
性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2.棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制）,，酶標板加上覆膜，37 溫育1小時,。
3.棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4.每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ,，加上覆膜，37 溫育1小時,。
5.棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液90,酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘,，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）,。
7.每孔加終止溶液50,，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。
8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）。
注：
1.試劑準備:所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染,。
2.加樣:加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗,。
3.溫育:為防止樣品蒸發(fā),，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài),；同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4.洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10 ）,，以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液。
6.反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。
7.底物:底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
洗板方法:
1.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
2.自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
計算:各標準品及樣本值扣除空白孔 值后作圖（七點圖）,，如設(shè)置復(fù)孔,，則 應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）,， 值為橫坐標（對數(shù)坐標）,，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curve expert1.3,，根據(jù)樣品 值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,，乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
說明:
1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析,，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
2.zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性,、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),，請務(wù)必準備充足的標本備份。
3.在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
4.試劑盒保存:請收到試劑盒后盡快將標準品,、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請置于4 ,，長期保存則置于-20,。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕,。
5.濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
6.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
7.有效期:6個月,。
