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在ELISA中實驗條件的選擇

時間：2011/11/11閱讀：656
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在ELISA中,，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是非常重要的,，其中包括: 　　
1.固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯,、聚苯乙烯,、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板,、試管,、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板,。不管何種載體,，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng),，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
2.包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時,，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時,。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μgml等）進(jìn)行包被后,，在其它試驗條件相同時,，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μgml,。
3.酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）,。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度,。
4.酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉,、安全、有明顯地顯色反應(yīng),，而本身無色,。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù),。有條件者應(yīng)使用不致癌,、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后,，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜,。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入,。

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