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1、如何選用培養(yǎng)基,？
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長,?？傊琈EM做粘附細胞培養(yǎng),、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng),，各種目的無血清培養(yǎng)的是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。在開始進行新的細胞培養(yǎng)時,，可以參考下表所列的條件： 細胞系 細胞類型 種 組織 推薦使用的培養(yǎng)基
293 成纖維細胞 人 胚胎腎 MEM,，10% 熱滅活馬血清
3T6 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮細胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纖維細胞 小鼠 結(jié)締組織 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮細胞 小鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纖維細胞 倉鼠 腎 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮細胞 人 乳房 McCoy', 10% 胎牛血清
BT 成纖維細胞 牛 鼻甲骨細胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮細胞 人 結(jié)腸腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮細胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮細胞 倉鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮細胞 大鼠 肝臟 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮細胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮細胞 貓 腎 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纖維細胞 猴 腎 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮細胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴細胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴細胞 人 T細胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮細胞 倉鼠 腎 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮細胞 人 結(jié)腸直腸腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮細胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA （in suspension, S-MEM）
HEp-2 上皮細胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴細胞 人 早幼粒細胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮細胞 人 纖維肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮細胞 人 結(jié)腸腺癌 McCoy's , 10% 胎牛血清
HUVEC 內(nèi)皮細胞 人 臍帶 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素鹽 100 ug/ ml
I-10 上皮細胞 小鼠 睪丸癌 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴細胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮細胞 人 絨毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纖維細胞 大鼠 肉瘤 McCoy's , 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴細胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴細胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮細胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白細胞 人 紅白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮細胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌細胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮細胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 馬血清
McCoy 成纖維細胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮細胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b 類巨噬細胞 小鼠 骨髓單核細胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮細胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮細胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮膚 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮細胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮細胞 小鼠 腎上腺瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
2、為什么要熱滅活血清,？
加熱可以滅活補體系統(tǒng),。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮,，細胞和血小板釋放組胺,，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學(xué)研究,、培養(yǎng)ES細胞,、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清,。
3,、L－谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？
L－谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的,。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝,。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終確定,。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,，而氨對于一些細胞具有毒性。
4,、GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定,？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來保護,。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放L－谷氨酰胺供利用,。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解,，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎*降解,。
5,、為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色,，酸性時為黃色,，堿性時為紫色。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞,，尤其是哺乳類細胞時,，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,，一些研究人員在做流式細胞檢測時,，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
6,、如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞,？
用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200－2000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液,。輕輕混勻,，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞,?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞,。
7,、如何消除組織培養(yǎng)的污染？
當重要的培養(yǎng)污染時,，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先，確定污染物是細菌,、真菌,、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開,，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,，檢查HEPA過濾器,。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而,，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟,。
（1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度,。
（2）分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),，把選擇抗生素加入到每一個孔中,。例如，兩性霉素B推薦下列濃度,，0.25,，0.50，1.0,，2.0,，4.0,8.0 mg/ml。
（3）每天觀測細胞毒性指標,，如脫落,，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓,。
（4）確定抗生素毒性水平后,，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2－3代。
（5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代,。
（6）重復(fù)步驟4,。
（7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除,。
8,、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源,。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,，但是，如果沒有葡萄糖的話,，細胞也可以代謝丙酮酸鈉,。
9、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀,？
GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化,，儲存在2－8℃時,，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原,、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量,。推薦在－20℃儲存胎牛血清,，避免反復(fù)凍融。
10,、目錄上說,，Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱,。原因是什么,？
Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,，碳酸氫鈉的含量在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高,。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值,。Eagles液在空氣水平的CO2 中,，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸,。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,，用Hanks液就可以了,。
11、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標準檢驗程序,，而且除了這些標準檢測,，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學(xué)檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測
Sf9 細胞生長促進及方法學(xué)檢測
12、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎,？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么,？
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,，以便保持抑制胰蛋白酶的活性,。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞,，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子,。
13、制備 lipid-DNA的方法會影響轉(zhuǎn)染效率嗎,？
是的,。對于LIPOFECTAMlNE Reagent,，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中,?；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent,，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率,。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后,，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800μl）,。（注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合,。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體,，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。對于每一種脂質(zhì)體的詳細的信息可以參考產(chǎn)品說明書,。
14,、我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好,，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好,？
如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達,，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白,。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好,。在無血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白,。為了避免這一問題,，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物,。
15,、如何檢測內(nèi)毒素（熱源）水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的zui敏感和特異的檢測細菌內(nèi)毒素的方法,。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用,。內(nèi)毒素啟動一個細胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過修飾凝集素,，產(chǎn)生一種透明的膠,，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì),。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物,。
胎牛血清的內(nèi)毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的,。在對血清產(chǎn)品進行內(nèi)毒素檢測前,，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘,，以消除抑制劑,。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程,，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用,。）
16,、我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？
如果使用固體形式的培養(yǎng)基,，需要加入瓊脂,。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌,，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液,，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。
17,、20℃下配制的緩沖液,，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液,，PH值隨溫度變化而變化,。
下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況
例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78
緩沖系統(tǒng) pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃
Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280
18,、室溫下（25℃）配制的Tris-HCl溶液,，在37℃使用時PH值是多少？
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化,。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,，25℃，37℃時,，不同的PH值,。
4℃ 25℃ 37℃
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5
19、昆蟲細胞培養(yǎng)的zui適PH值和滲透壓是多少,？
生長培養(yǎng)基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響,。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細胞系時,，培養(yǎng)基的zui適滲透壓是 345－380mOsm/kg.,。為保證可靠和持久的細胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題,，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi),。
20、High Five細胞有任何其它名稱嗎,？
High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4,。
21、PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別,？
PFHM-II （Protein-free Hybridoma Medium）是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基,。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清,。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基,，也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì),。
22,、在High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？
High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80,，1.0 g/L Pluronic Poly-all,。
23、High Five細胞用多大的密度凍存,？
3.0x10E6 cells/ml
24,、在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解,。它是什么,？對我的細胞有害嗎？
可能是谷氨酰胺沉淀,，但是更可能是L-酪氨酸沉淀,。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,，而且比谷氨酰胺更加難以溶解,。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起,。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解,，對實驗不會有不利的影響。
25,、如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細胞,？能用胰蛋白酶消化嗎？
我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術(shù)破壞性zui小,，生活力zui高,。正如手冊上所顯示，通過使用巴氏德吸液管,，讓細胞上培養(yǎng)基流動,。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在必要的情況下,，才使用胰酶消化細胞,。
胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：
（1）去除培養(yǎng)基。
（2）用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞,，去除PBS.
（3）加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）,。
（4）37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動,。
（5）向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液,，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性,。）
（6）離心（1100rpm）沉淀細胞,。去除培養(yǎng)基。
（7）用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞,。傳代,。
26、在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時,，肝素的使用量是多少,？
為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液,。
27,、如何評估ES細胞合格的胎牛血清？
使用D3 ES細胞,。這是一個對于胎牛血清中生長促進,、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。
相關(guān)生長效率分析：
當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中,，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力,。
細胞毒分析：
當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力,。
相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：
檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力,。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大,，豐滿,，顏色較淺。
所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的,，培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問題,。（ESGRO或LIF經(jīng)常用來保持ES細胞處于未分化狀態(tài)。）
經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),，大約8批中有1批可以用來培養(yǎng)ES細胞,。
28、在重新凍存sf9細胞前,，它可以傳多少代,？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎,？
通常情況當細胞經(jīng)過30次傳代后,，應(yīng)該返回凍存。無論什么時候記數(shù)時,，都應(yīng)該檢查細胞活力,。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用,。如果活力和加倍時間下降,，它們的感染力將不在是有效的。
