細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中水的質(zhì)量要求
提起細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),，每個(gè)經(jīng)歷過的實(shí)驗(yàn)者都會(huì)有這樣的領(lǐng)悟吧,，
細(xì)胞虐我千百遍，我待細(xì)胞如初戀。
明明小心翼翼的操作,，
細(xì)胞總會(huì)莫名其妙的被污染了,！
莫名其妙的掛掉啦！
到底怎么回事呢,？
其實(shí)造成細(xì)胞污染的因素不單單是微生物,，培養(yǎng)環(huán)境中所摻雜的物質(zhì)也可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。水是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境,，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中,，才能為細(xì)胞吸收和排泄。對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞來說,，水是所有細(xì)胞培養(yǎng)液和試劑中簡(jiǎn)單,、但也是重要的組分。所以,，細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高,，培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微,，有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長(zhǎng),，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
水中的雜質(zhì)對(duì)水質(zhì)有不同影響：
1.離子——平衡滲透壓,；一些重金屬 (Cadmium)對(duì)細(xì)胞毒害大,，即便劑量很低 (< 0.1 ppb)；
2.微生物——污染,，改變微環(huán)境如pH,，影響增殖，死后釋放內(nèi)毒素等,；
3.內(nèi)毒素——改變細(xì)胞外形,、活化細(xì)胞、促進(jìn)或抑制細(xì)胞分裂,、影響細(xì)胞附著等,；
4.有機(jī)物——影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。
水質(zhì)評(píng)價(jià)常用的指標(biāo)：
1. 電阻率（electrical resistivity）
衡量實(shí)驗(yàn)室用水導(dǎo)電性能的指標(biāo),，單位為MΩ•cm,，隨著水內(nèi)無機(jī)離子的減少電阻數(shù)值逐漸變大。
2. 異體菌落數(shù)（Heterotrophic bacteria count,，HBC）
衡量實(shí)驗(yàn)室用水微生物的指標(biāo),，單位為cfu/mL。
3. 有機(jī)物（Total Organic Carbon ,，TOC）
水中碳的濃度,，反映水中可氧化的有機(jī)化合物的含量，可間接反映出水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb,。
4. 內(nèi)毒素（Endotoxin）
革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖細(xì)胞壁碎片,，又稱之為“熱原”,，單位EU/mL,。
參考標(biāo)準(zhǔn)化組織的實(shí)驗(yàn)室純水規(guī)范ISO3696，美國(guó)CLSI和ASTM D1193的試劑純水規(guī)范,，我國(guó)GBT6682和GBT 30301的試驗(yàn)用水指導(dǎo),，《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源的描述標(biāo)準(zhǔn)與管理規(guī)范》用水指導(dǎo)，結(jié)合多年的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn),，總結(jié)出細(xì)胞培養(yǎng)用水對(duì)水質(zhì)的要求,。
細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水質(zhì)的要求：
1.一定要無菌：HBC < 0.01 cfu/mL
2.無蛋白及核酸酶和內(nèi)毒素：無內(nèi)毒素或無熱源<0.03EU/mL
3.阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)的有機(jī)物含量要低：TOC <5 ppb
4.去除離子含量：電阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)
細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中純水機(jī)的配置要求
細(xì)胞培養(yǎng)過程中，各種培養(yǎng)液和試劑的配制用水均需要經(jīng)過嚴(yán)格的純化處理,，不含離子和其他的雜質(zhì),，即使是儲(chǔ)存試劑的玻璃器皿，在自來水沖洗過后也應(yīng)用超純水漂洗三次以上,。目前,，市場(chǎng)上供應(yīng)的純水裝置種類較多，比如自來水進(jìn)水同時(shí)制備二級(jí)純水和超純水的上海樂楓Genie一體化純水裝置,，可以由自來水進(jìn)水通過預(yù)處理柱P Pack,、反滲透柱RO Pack及EDI（連續(xù)電流電去離子）模塊等純化后達(dá)到二級(jí)純水，儲(chǔ)存于水箱中以滿足日常的清洗應(yīng)用,；水箱中的水再經(jīng)過U Pack超純化柱去離子,，紫外燈照射殺菌并降低有機(jī)物含量，后經(jīng)終端濾器RephiBio過濾,，以獲得無菌,、無熱源、無核酸酶的超純水,。
水路圖
要想達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)用水的水質(zhì)要求,，純水機(jī)的配置非常關(guān)鍵，帶有消毒模塊的純水水箱,、終端過濾器,、取水水質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等配置都關(guān)系著產(chǎn)水水質(zhì)是否達(dá)標(biāo)。
純水的儲(chǔ)存對(duì)保持純水的質(zhì)量是至關(guān)重要的,，由于周圍環(huán)境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH,，所以儲(chǔ)存水的容器要盡量密封，避免和外界過多接觸,，抑制微生物生長(zhǎng),。如Genie純水設(shè)備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過濾器，能夠大限度的保證水箱內(nèi)的純水水質(zhì)。
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| 水箱空氣過濾器（含CO2吸附劑） | 200/350L 水箱空氣過濾器 |
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| 主控屏顯示水箱水循環(huán)狀態(tài) | |
終端濾器可用于去除純水中特定類型的污染物,，滿足不同實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用需求,。對(duì)于細(xì)胞體外培養(yǎng)可以選用RephiBio Filter 純水終端過濾器，安裝在樂楓超純水系統(tǒng)的出水口,，可有效去除水中的熱原（內(nèi)毒素）,、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì),，制備符合細(xì)胞培養(yǎng)用水要求的超純水（無熱原,、無DNase、無RNase,、無菌）,。
對(duì)于超純水而言需要格外注意終端水質(zhì)的TOC、電阻率,、細(xì)菌和內(nèi)毒素的含量,，必須做到即取即用，因此取水的遠(yuǎn)程監(jiān)控和水質(zhì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要,。目前已有廠家可以提供與手柄通過無線連接的實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)（如上面提到的Genie）,，將水機(jī)和取水手柄分別放在潔凈間的內(nèi)外，通過無線控制取水手柄達(dá)到超純水的取用和實(shí)時(shí)檢測(cè)水的電阻率和TOC數(shù)值,，非常適合無菌環(huán)境下的操作,，大限度減少污染。
| 無線 · 自由 |  |
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| 手柄觸屏信息
? 系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)：待機(jī)，泄壓,，循環(huán),，產(chǎn)水 ? 水箱液位：0%或者L ? 純水（超純水）水質(zhì)參數(shù)：電阻率、TOC,、溫度 |
終 端 水 質(zhì) 實(shí) 時(shí) 監(jiān) 測(cè) |
結(jié)合上述用水要求,，為大家推薦兩款制備超純水的水機(jī)，Genie G一體化純水儀和Genie PURIST 超純水儀,。
Genie G一體化純水儀 以自來水為進(jìn)水制備超純水和 EDI 二級(jí)純水 | 性能指標(biāo)
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Genie PURIST 超純水儀 以純水（EDI 純水,，RO 水或蒸餾水等）為進(jìn)水，制備實(shí)驗(yàn)室超純水,。 | 性能指標(biāo)
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【注意事項(xiàng)】
1.超純水應(yīng)當(dāng)注意使用時(shí)間,，應(yīng)該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質(zhì)導(dǎo)致水質(zhì)下降,。
2.在合適的環(huán)境使用超純水,。環(huán)境中的VOC（揮發(fā)性有機(jī)物）,，細(xì)菌等都會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)。
3.培養(yǎng)細(xì)胞的容器應(yīng)當(dāng)潔凈無污染,。
4.配制離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時(shí),，宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液,，緩沖液用水可以選用裝配樂楓低鎂型純化柱的純水機(jī),，避免鈣、鎂離子促使細(xì)胞凝聚作用的產(chǎn)生,。
不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇指南
細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌,、適宜溫度,、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等）,，使之生存、生長(zhǎng),、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法,。細(xì)胞培養(yǎng)的整個(gè)流程中實(shí)驗(yàn)用水貫穿每一個(gè)環(huán)節(jié)：
1.取材：組織的清洗和灌注試劑用水，如PBS緩沖液,、Hanks液的配制,；
2.原代培養(yǎng)：1640、DMEM等培養(yǎng)基用水,，明膠等支持物的配制,，添加藥物、檢測(cè)試劑的配制,；
3.傳代培養(yǎng)：胰酶等消化液的配制,；
4.凍存：細(xì)胞凍存液DMSO的配制。
細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞類型一般分為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),、植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng),，其中難的是動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)除了需要無菌,、溫度,、氣體、滲透壓,、pH等基本條件,，它還需要血清、支持物等特殊物質(zhì),，其中原代細(xì)胞的培養(yǎng)是難的,。植物細(xì)胞的培養(yǎng)需要光照和激素，而且培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)比較成熟,。微生物培養(yǎng)多為單細(xì)胞生物,，微生物人工培養(yǎng)的條件比動(dòng)植物細(xì)胞簡(jiǎn)單得多,，蛋白胨、麥芽汁,、酵母膏等天然培養(yǎng)基即可滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)要求,，其中厭氧微生物培養(yǎng)比好氧微生物復(fù)雜，需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度,。
由于細(xì)胞的種類和培養(yǎng)條件不同,，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中雜質(zhì)的含量要求也不同，那么配制培養(yǎng)基或試劑用水的選擇大有講究,，不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水的指標(biāo)如下：
細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇
細(xì)胞類型 | 純水等級(jí) | 電阻率 (MΩ·cm) | TOC (ppb) | 微生物 (cfu/mL) | 內(nèi)毒素(Eu/mL） | 核酸酶 (pg/mL) |
動(dòng)物細(xì)胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
植物細(xì)胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
微生物 | 實(shí)驗(yàn)室Ⅱ級(jí)純水 | >10 | <50 | <1 | NA | NA |
從上表可以看出,，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)去除內(nèi)毒素和核酸酶的要求很高，用于這兩類細(xì)胞培養(yǎng)可以選擇商品化的細(xì)胞培養(yǎng)用水,，另外去除純水中的內(nèi)毒素和核酸酶可以通過在純水機(jī)的取水口安裝終端濾器達(dá)到,。
各種細(xì)胞培養(yǎng)用水的比較
細(xì)胞培養(yǎng)用水 | 制備方法 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
商品化細(xì)胞培養(yǎng)用水 | 純水或超純水進(jìn)行多效蒸餾制成，嚴(yán)格控制熱源,、無菌,、內(nèi)毒素、pH,、滲透壓等指標(biāo) | 水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)程度化高,，可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性 | 價(jià)格昂貴 |
DEPC水 | DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，無RNase,、DNAase和proteinase,。 | *去除核酸酶 | 價(jià)格昂貴，未去除內(nèi)毒素 |
終端濾器過濾超純水 | 采用0.22µm的過濾膜,，可有效去除水中的熱原（內(nèi)毒素）,、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì),。 | 性價(jià)比高,，供水量大 | 對(duì)取水環(huán)境要求高 |
樂楓 RephiBio 終端過濾器采用0.22µm帶正電荷的雙層尼龍66過濾膜，可制備符合生物領(lǐng)域應(yīng)用要求的超純水（無熱原,、無DNase,、無RNase、無菌）,，純水中內(nèi)毒素含量低于0.001 Eu/mL,，核酸酶的含量低于可檢測(cè)范圍，微生物的含量低于0.1 cfu/mL,，可以滿足動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的需求,。
Tips: 通常情況下樂楓RephiBio 終端過濾器的更換周期為3 個(gè)月，以保證使用效果,。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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