原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國(guó)
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張曉夕
在整個(gè)制藥行業(yè)中,，重組單克隆抗體 (mAb) 為生物治療產(chǎn)品在銷售額和臨床份額的快速增長(zhǎng)起到了重要作用。最近,，因?yàn)楠?dú)特的治療效果,，復(fù)雜的蛋白質(zhì)包括抗體-藥物偶聯(lián)物 (ADC)、雙特異性抗體和融合蛋白等重新獲得了科學(xué)家們的特別關(guān)注,。在蛋白質(zhì)藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attribute, CQA）評(píng)估過(guò)程中,，電荷異質(zhì)性需要對(duì)蛋白分子進(jìn)行深入的結(jié)構(gòu)表征，以確保其安全性,、有效性和效力,。
此外，對(duì)電荷變異體的監(jiān)測(cè)也是蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量控制（QC）中必要的步驟,。目前,，主要有兩種檢測(cè)蛋白質(zhì)藥物電荷變異體的方法：離子交換(IEX) 色譜和成像毛細(xì)管等電聚焦(iCIEF) 或 CIEF,，兩者傳統(tǒng)上都使用 紫外（UV） 作為檢測(cè)器。UV檢測(cè)雖然具有良好的穩(wěn)定性和靈敏度,，但受限于其定性能力,，無(wú)法對(duì)分離后的電荷變異體進(jìn)行更深入的鑒定。為了分析電荷異構(gòu)體的成因,，必須進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析,。高分辨率質(zhì)譜（HRMS）是定性蛋白質(zhì)分析的有力手段之一。然而,，由于所用溶液體系的限制,，傳統(tǒng)上IEX 和 iCIEF 不能直接與質(zhì)譜連接。鑒于iCIEF在蛋白質(zhì)電荷變異體分析中具有分辨率高,、通量高等優(yōu)點(diǎn),，已經(jīng)逐漸成為生物制藥行業(yè)生產(chǎn)與質(zhì)量控制階段的金標(biāo)準(zhǔn)。因此,，科學(xué)家們也在嘗試各種將iCIEF與高分辨質(zhì)譜直接連接的技術(shù),。其中一種方法是基于芯片的直連技術(shù)，然而該方法是使用化學(xué)試劑形成pH梯度,，穩(wěn)定性有所欠缺,，且分辨率會(huì)下降；其他的直連方法在通量,、穩(wěn)定性以及與質(zhì)譜離子源連接的便利性等方面均有不足,。
本文中所使用的CEInfinite (Advanced Electrophoresis Solution Ltd., AES) iCIEF平臺(tái)，與該公司的專利卡柱和兩性電解質(zhì)配合使用,，對(duì)mAb,、ADC等分子的電荷變異體均可實(shí)現(xiàn)高分辨率分離，且兼具良好的穩(wěn)定性,。更為重要的是,，所用溶液體系中無(wú)甲基纖維素、尿素等,，兩性電解質(zhì)也與質(zhì)譜兼容,，這使得iCIEF與高分辨質(zhì)譜在線直連測(cè)量電荷變異體完整蛋白分子量成為可能。該平臺(tái)與質(zhì)譜離子源部分連接簡(jiǎn)單,，無(wú)需額外接口（圖1）,，不同工作模式切換簡(jiǎn)便。
圖1. CEInfinite iCIEF平臺(tái)質(zhì)譜直連模式工作原理圖
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在本文中,，我們對(duì)NIST mAb（NIST8671）,、bevacizumab和pembrolizumab，以及T-DM1這一賴氨酸偶聯(lián)的ADC藥物進(jìn)行了iCIEF-HRMS在線直連分析。根據(jù)每個(gè)分子及其電荷變異體的pI分布,，我們選擇了不同范圍的兩性電解質(zhì)（表1）,，目的在于實(shí)現(xiàn)不同電荷變異體之間更好的分離。
表1. 樣品配制
對(duì)于每個(gè)分子,，我們也根據(jù)其不同性質(zhì)優(yōu)化了iCIEF實(shí)驗(yàn)條件，詳見(jiàn)表2,。
表2. iCIEF分離條件
實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
由于每個(gè)蛋白及其電荷變異體的等電點(diǎn)（pI）分布范圍存在差異,，為了在直連質(zhì)譜時(shí)得到最好的分離效果，需要進(jìn)一步優(yōu)化iCIEF分離條件,。優(yōu)化時(shí),，先用pH范圍較寬的兩性電解質(zhì)分析目標(biāo)蛋白得到初步結(jié)果，然后再根據(jù)初步結(jié)果中每個(gè)組分不同的pI分布范圍,，選用相應(yīng)的窄pH范圍兩性電解質(zhì)（優(yōu)化過(guò)程數(shù)據(jù)未展示）,。
在iCIEF的聚焦過(guò)程中，蛋白會(huì)在電場(chǎng)形成的pH梯度中遷移,，直至到達(dá)pH=pI的位置,，遷移停止。由于蛋白在pI處停止后易沉淀,，通常會(huì)加入一定濃度的尿素助溶,。然而尿素與質(zhì)譜不兼容，為了解決這個(gè)問(wèn)題,，我們的實(shí)驗(yàn)中換用甲酰胺代替尿素,，在助溶的同時(shí)，也與質(zhì)譜兼容,；對(duì)于每個(gè)樣品,，甲酰胺的濃度同樣也進(jìn)行了優(yōu)化（數(shù)據(jù)未展示），對(duì)于大部分樣品,，10%(v/v)甲酰胺是最適合的條件,。
在iCIEF-MS直連模式中，需要兩路輔助溶劑,。一路被稱為mobilization solution（蛋白從卡柱上被推出的溶液,，由iCIEF系統(tǒng)配備的蠕動(dòng)泵完成），該溶液通常為10mM醋酸溶液或0.1-0.5%甲酸水溶液,；另一路為make-up solution(由HPLC的泵模塊提供,，在柱后與mobilization混合) ，通常使用0.1%甲酸,，水：乙腈=1：1的溶液,。
因?yàn)檫@兩路溶液的流速會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，我們同樣對(duì)這兩個(gè)流速分別進(jìn)行了優(yōu)化，mobilization solution流速優(yōu)化范圍30-100nL/min, make-up solution流速優(yōu)化范圍1-10μL/min,，發(fā)現(xiàn)mobilization solution流速在40-50nL/min之間iCIEF分辨率最好,，50-100nL/min分辨率會(huì)下降；mobilizaiton solution= 5μL/min,，質(zhì)譜靈敏度最好,。
iCIEF-MS直連模式的重復(fù)性
在本實(shí)驗(yàn)中，NIST mAb被用于系統(tǒng)穩(wěn)定性測(cè)試,。如圖2所示,，圖2A為NISTmAb三針平行進(jìn)樣結(jié)果，可見(jiàn)質(zhì)譜總離子流圖(total ion current, TIC chromatogram)和主峰解卷積結(jié)果均具有良好的重現(xiàn)性,；圖2B對(duì)NIST mAb的TIC和iCIEF-UV譜圖進(jìn)行了對(duì)比,，可見(jiàn)iCIEF分離出的五個(gè)電荷異質(zhì)體峰均可與TIC中的峰一一對(duì)應(yīng)。需要注意的是,，由于系統(tǒng)直連的模式,，iCIEF分離后的峰是按照pI由大到小的順序依次被引入質(zhì)譜離子源的，故TIC圖上最先被檢測(cè)到的是pI值最大的堿峰,，TIC與iCIEF-UV譜圖中峰的分布呈鏡像關(guān)系,。
(A)
(B)
圖2.iCIEF-MS系統(tǒng)穩(wěn)定性測(cè)試。
(A),，NIST mAb三針平行進(jìn)樣,。
(B)，NIST mAb 質(zhì)譜總離子流圖(TIC)與iCIEF-UV譜圖對(duì)比,。
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iCIEF-MS分析bevacizumab
圖3展示了iCIEF-MS分析bevacizumab的結(jié)果,。從圖3A的iCIEF-UV譜圖中可以看出，總共有六個(gè)電荷變異體的峰被分離并鑒定到,，包括三個(gè)酸峰(A1-A3),，兩個(gè)堿峰(B1-B2)和主峰(M)，均可在TIC-MS譜圖中找到對(duì)應(yīng)的峰,。圖3B為使用Thermo Fisher Biopharma Finder 5.0 (BPF 5.0)軟件對(duì)各個(gè)電荷變異體進(jìn)行解卷積之后的結(jié)果,，可見(jiàn)在兩個(gè)堿峰中，主要的電荷變異體分別為重鏈末端保留一個(gè)賴氨酸(B1)和兩個(gè)賴氨酸均被保留(B2)的形式,；在酸峰中,，主要觀察到的電荷變異體為糖化(+162Da)。
表3列出了iCIEF-MS鑒定到的bevacizumab電荷變異體,。對(duì)于酸峰中常見(jiàn)的脫酰胺化修飾,，由于其修飾后分子量?jī)H增加0.984Da,，通常需要在肽圖層面上進(jìn)一步確認(rèn),。
(A)
(B)
圖3. iCIEF-MS分析bevacizumab。
(A), TIC-MS與iCIEF-MS譜圖對(duì)比,。
(B), 經(jīng)iCIEF分離后的bevacizumab電荷變異體質(zhì)譜數(shù)據(jù)解卷積結(jié)果。
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表3. iCIEF-MS鑒定到的bevacizumab電荷變異體
iCIEF-MS分析pembrolizumab
下圖4及圖5展示了我們使用iCIEF-MS直連技術(shù)分析pembrolizumab電荷變異體的結(jié)果,，可見(jiàn)即使是pI僅差0.02的堿峰B1和主峰,，也可以在iCIEF上得到基線分離(圖4A)，隨后的高分辨質(zhì)譜分子量測(cè)定結(jié)果顯示該堿峰與主峰相比,，主要差異是其中一條重鏈的N端未發(fā)生焦谷氨酸環(huán)化（圖5B-C）,。另外觀察原始質(zhì)譜譜圖不難發(fā)現(xiàn)，得益于Orbitrap高分辨質(zhì)譜的靈敏度,，即使是強(qiáng)度比主峰低2~3個(gè)數(shù)量級(jí)的堿峰B3,，仍可得到糖型分布清晰的譜圖，并可通過(guò)解卷積觀察到該峰中各個(gè)組分的分子量,，例如重鏈末端丟失GK(-185Da)的電荷變異體也在堿峰B3中被鑒定到（圖5D）。表4展示了iCIEF-MS直連測(cè)得的每個(gè)峰中主要的電荷變異體種類,。
(A) (B)
圖4. (A), pembrolizumab iCIEF- UV 分離譜圖,。(B), pembrolizumab各個(gè)電荷變異體百分含量，上樣量為柱上1.6μg,。A1-A4, 酸峰; Main, 主峰; B1-B3, 堿峰,。
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圖5. iCIEF-MS分析pembrolizumab電荷變異體質(zhì)譜圖及解卷積譜圖。
(A),，主峰與所有堿峰原始質(zhì)譜圖對(duì)比,。
(B)，堿峰B1(pI=7.59)與主峰(pI=7.57)解卷積結(jié)果鏡像圖對(duì)比,。
(C),，基于肽圖得到的主峰和堿峰B1重鏈N端焦谷氨酸環(huán)化比率。
(D),，堿峰B3解卷積結(jié)果,。
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表4 iCIEF-MS在線直聯(lián)鑒定pembrolizumab電荷變異體。HC,，重鏈,。
iCIEF-MS分析ADC
ADC是一類經(jīng)過(guò)細(xì)胞工程設(shè)計(jì)，將小分子藥物通過(guò)linker分子偶聯(lián)至mAb分子特定氨基酸位點(diǎn)上,，通過(guò)mAb對(duì)細(xì)胞表面的靶點(diǎn)精確識(shí)別后,，將小分子藥物定向?qū)氚┘?xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)殺滅癌細(xì)胞,，減少對(duì)正常細(xì)胞殺傷的一類蛋白質(zhì)藥物,。由于小分子藥物的偶聯(lián)增加了產(chǎn)品的復(fù)雜性，故在質(zhì)譜分析之前,，通過(guò)各種分離技術(shù)對(duì)偶聯(lián)了不同數(shù)目小分子藥物的ADC進(jìn)行預(yù)分離,，可大大降低質(zhì)譜數(shù)據(jù)的復(fù)雜度和解析難度。圖6展示了iCIEF-UV分析ADC的譜圖，可見(jiàn)由于偶聯(lián)小分子藥物的數(shù)目不同,，ADC的電荷異質(zhì)性也不同,，可以在iCIEF層面上得到分離。圖7展示了iCIEF-MS分析ADC的質(zhì)譜譜圖及解卷積結(jié)果,，可見(jiàn)iCIEF將對(duì)偶聯(lián)了不同數(shù)目小分子藥物的ADC根據(jù)其電荷異質(zhì)性進(jìn)行分離后,，能夠減少質(zhì)譜譜圖中相鄰信號(hào)之間的干擾，從而降低質(zhì)譜譜圖的復(fù)雜度,，使質(zhì)譜譜圖的解析更精確和便利,。
圖6. iCIEF-UV 分析T-DM1譜圖，上樣量1.6μg,。D0-D10, 小分子藥物偶聯(lián)數(shù)目,。
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圖7. iCIEF-MS分析T-DM1質(zhì)譜譜圖及解卷積結(jié)果（分離后未偶聯(lián)小分子藥物的組分，D0）,。iCIEF分離大大降低了譜圖復(fù)雜度,。
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基于iCIEF分離的
蛋白電荷變異體離線餾分收集
iCIEF-MS可以從完整蛋白層面上提供蛋白電荷變異體的分子量信息，如需更多修飾位點(diǎn)層面的信息,，可以對(duì)iCIEF分離的蛋白電荷變異體離線餾分收集后進(jìn)行酶解,，隨后使用HPLC-MSMS進(jìn)行肽圖表征。圖8展示了pembrolizumab蛋白電荷變異體離線餾分收集的iCIEF-UV譜圖,，更多詳細(xì)信息可參考已發(fā)表文獻(xiàn)[1],。
(A)
(B)
圖8. Pembrolizumab 電荷變異體離線餾分收集及確認(rèn)。
(A) 離線餾分收集,。iCIEF-UV為10針平行進(jìn)樣的重疊,，插入表格為每個(gè)峰以峰面積計(jì)算的相對(duì)含量和10針平行進(jìn)樣的CV。
(B) 峰純度確認(rèn),，每個(gè)峰均為5針平行進(jìn)樣,，同一個(gè)pI收集峰的混合。
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在生物醫(yī)藥行業(yè)中,，快速且準(zhǔn)確的電荷變異體分析是關(guān)鍵需求之一,。本文中使用的iCIEF在線直連高分辨質(zhì)譜工作流程，能夠克服CE-MS在靈敏度,、重現(xiàn)性等方面的不足,，特別是我們使用的CEInfinite平臺(tái)可以靈活的在不同工作流程之間轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)電荷變異體表征中的“一站整合式” iCIEF分析,。
原文參考
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參考文獻(xiàn)
[1] X. Zhang, T. Chen, V. Li, T. Bo, M. Du, T. Huang, Cutting-edge mass spectrometry strategy based on imaged capillary isoelectric focusing (iCIEF) technology for characterizing charge heterogeneity of monoclonal antibody, Analytical Biochemistry 660 (2023) 114961.
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