原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國
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李丕
食品組學
感官組學和風味組學是食品組學的重要分支,，旨在分析可能對食物的味道和氣味起關鍵作用的化合物,，同時表征其生成途徑，指導優(yōu)化加工工藝,，還可以通過某種食品的感官和風味特征評價其真實性,。感官和風味組學的關鍵實施要素是將先進的檢測技術(shù)與感官分析和嗅覺測量相結(jié)合，使用GC-MS結(jié)合化學計量方法對芳香化合物進行非靶向分析和統(tǒng)計。
以下通過5個案例介紹賽默飛GC-MS家族在啤酒,、羊肉、茶葉,、精油風味組學和橙汁真實性的應用。
01
啤酒風味 - ISQ
揮發(fā)性有機化合物 (VOC) 直接影響啤酒的風味,。它們與釀造原材料、酵母代謝,、微生物污染和老化有關。因此將啤酒的化學組成與產(chǎn)品評估相結(jié)合以闡釋VOC 對啤酒香氣/接受度的影響非常重要,。
巴西坎皮納斯大學化學研究所的Paiva使用全二維氣流調(diào)制器與ISQ7000聯(lián)用,，搭建GC×GC-MS分析平臺對市場上的啤酒進行風味組學研究，研究成果發(fā)表在色譜A雜志[1],。
該工作根據(jù)Untappd® 平臺的啤酒平均等級得分（0-5分）選定樣品,，共2組：第 1組平均評分低于 3 ，是消費者偏好較低的啤酒,；第 2組平均評分大于3,，是公眾偏好度高的啤酒。風味物質(zhì)的萃取富集通過TriPlus RSH自動進樣器的HS-SPME組件完成（DVB/CAR/PDMS 萃取頭）,，隨后通過ISQ7000進行非靶向分析,。
圖 1-1. 使用HS-SPME-GC ×GC-MS 測試樣品的總離子流圖。( A ) 樣品 #1 – 第2組; ( B ) 樣品 #13 – 第 1 組,；(C)方法空白,。
通過NIST譜庫結(jié)合RI做峰定性鑒定，然后通過化學計量學手段對化合物做差異性分析,。
在第 2 組啤酒樣品中發(fā)現(xiàn)29 種組分濃度高于第1組,，主要是非氧化單萜和含氧萜烯。萜烯是啤酒花精油中最豐富的揮發(fā)性化合物,，它們對麥芽汁表現(xiàn)出高親和力,，可能會進入啤酒對其風味產(chǎn)生影響，因此是啤酒釀造商很感興趣的化合物。另外,，發(fā)現(xiàn)2-乙基-1-己醇和 2-十一烷醇僅在第 2 組啤酒樣品中存在,， 2-十一烷醇賦予啤酒新鮮和菝葜屬性。
最后,，使用TriPlus RSH ,、全二維氣流調(diào)制器與ISQ7000聯(lián)用，可以生成與香氣相關的指紋,，并闡釋造成消費者喜好差異的化合物分子,，是研究消費者對拉格啤酒偏好的有趣解決方案。
圖1-2. ISQ7610儀器圖片
02
羊肉風味 – GC-Orbitrap 聯(lián)合 LC-Orbitrap
風味和香氣感覺不僅來自揮發(fā)性化合物,，而且還歸因于非揮發(fā)性物質(zhì)以及釋放揮發(fā)性化合物的基質(zhì)類型,。中國農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所張軍民團隊對高肌內(nèi)脂肪 (IMF)和低 IMF 胡羔羊進行了脂質(zhì)組學和揮發(fā)性組學分析，旨在詳細說明具有不同 IMF 含量的個體的脂質(zhì)和香氣化合物譜的變化,，并確定導致羊肉香氣譜差異的脂質(zhì),，研究成果發(fā)表在Food Chemistry 雜志[2]。
該研究通過LC-Orbitrap/MS詳細闡明具有不同 IMF 含量的羊肉的脂質(zhì)類別和脂質(zhì)分子譜,，總共確認了 842 種脂質(zhì),，其中79 種分子受到IMF含量影響而在各組之間存在差異；通過GC-Orbitrap/MS 在60,000 FWHM分辨率全掃描模式鑒定和半定量了羊肉中55種香氣化合物,，其中15種化合物（主要來自脂質(zhì)氧化）對羊肉的整體香氣影響最大,；最后使用偏最小二乘回歸 (PLS-R) 確定芳香化合物與脂質(zhì)之間的關系。
定性識別
其中芳香化合物的定性鑒定是通過與 NIST和 Wiley 譜庫,、自動計算線性保留指數(shù)及差值,、和風味標準品比較得到的，半定量則通過使用內(nèi)標（2-甲基-3-庚酮）進行,。
定量測定
值得一提的是，對于氣味活性值 (OAV) > 1 的芳香化合物,，通過空白基質(zhì)匹配曲線來準確定量,，特征離子(m/z)通過標準品確定，標準曲線的濃度范圍為 10 mg/L 至 2 g/L,，R2 > 0.99,。
一次進樣，兼具非靶向和靶向分析
本工作中GC-Orbitrap/MS以全掃描模式采集數(shù)據(jù),，后處理時,，既可以對全掃描譜圖通過非靶向篩查方法對未知物定性表征，也可以從全掃描譜圖中提取關鍵化合物特征離子通過靶向方法進行定量,，而無需二次進樣,。
表2-2. 15種關鍵芳香化合物的定量基質(zhì)匹配標準曲線（GC-Orbitrap/MS）（點擊查看大圖）
圖2-1. Orbitrap Exploris GC 240 儀器圖片
（分辨率高達240K）
03
橙汁真實性 – GC-Orbitrap
食品真實性是全世界都非常關注的領域。用濃縮（FC）橙汁代替非濃縮（NFC）橙汁是一種新的摻假問題。中國檢科院的陳穎教授團隊使用HS-SPME-GC-Orbitrap/MS結(jié)合化學計量學來區(qū)分NFC和 FC 橙汁,，旨在研究 NFC 和 FC 橙汁之間的差異,，探索橙汁加工過程中差異揮發(fā)性化合物形成的根本原因，研究成果表在 LWT 雜志[3],。
定性識別
化合物的識別鑒定通過NIST檢索評分 (RSI) ,、及GC-Orbitrap獨有的高分辨率過濾 (HRF) 評分進行，并通過TraceFinder軟件自動計算線性保留指數(shù)及差值輔助定性,。共鑒定出71種揮發(fā)性化合物,。
差異分析
共分析了 126 個果汁樣品中的 71 種揮發(fā)性化合物，通過內(nèi)標法半定量篩選出 25 種差異性組分,，由6種醇,、8種萜烯、9種酯和2種酮組成,，可用于區(qū)分 NFC 橙汁和 FC 橙汁,。
關鍵組分與加工工藝探討
結(jié)合果汁加工階段探討了25種關鍵化合物的具體變化，結(jié)果表明濃縮處理是導致 NFC 和 FC 橙汁揮發(fā)性成分差異的關鍵加工步驟,，濃縮處理后,，FC橙汁中這些化合物的濃度顯著降低；熱滅菌導致的變化程度遠小于濃縮,。
真實性評價
基于 25 種差異化合物構(gòu)建 PLS-DA 模型并用于商業(yè)橙汁鑒定,。分析了29種商品橙汁（14種NFC和15種FC），結(jié)果顯示所有的商品NFC樣本都與標簽一致,；而15個商品FC樣本中有2個被錯誤的檢測為NFC,，這是因為這2個誤判的樣本中添加了橙漿，橙漿與橙汁中揮發(fā)性組分的濃度呈正相關,。該項研究證明,，使用 HS-SPME-GC-MS 結(jié)合化學計量分析在NFC 和 FC 橙汁鑒別方面具有巨大潛力。
圖3-1. 實驗設計（點擊查看大圖）
表3-1. 25種關鍵化合物在不同加工工藝的含量差異
（點擊查看大圖）
04
茶葉香氣 – GC-Orbitrap 結(jié)合
Compound Discoverer
我們采用Orbitrap Exploris GC結(jié)合HS-SPME Arrow分析多個不發(fā)酵茶,、半發(fā)酵茶和發(fā)酵茶樣品,，通過Compound Discoverer組學分析軟件的非靶向workflow自動進行解卷積和定性分析，包括EI和PCI聯(lián)合預測驗證,，得到最準確的分析結(jié)果,，該方法可廣泛用于非靶向風味組學的研究中。
圖4-1. Compound Discoverer 組學分析軟件中的全自動EI Workflow（點擊查看大圖）
圖4-2. Compound Discoverer 組學分析軟件中的全自動的PCI Workflow（點擊查看大圖）
差異香氣化合物
與其他品種茶葉樣品比較,，正山小種的香氣特征為鐮葉芹醇,、可卡醛等；福鼎白茶為 α-柏木烯,，植酮等,。
圖4-3. CD軟件自動繪制的不同茶葉PCA圖
（點擊查看大圖）
圖4-4. CD軟件自動繪制的火山圖（點擊查看大圖）
定性確證
以RT=27.843min的化合物為例,，EI workflow解卷積定性為2-乙酰基吡咯（食用香精,，可用于茶葉）,，總得分97，HRF得分99.4,，相似度指數(shù)（SI）861,。接著用PCI workflow進一步驗證，軟件可根據(jù)反應氣類型自動尋找分子離子M+= 109.05269,，并在Predict Compositions節(jié)點自動預測可能的化學式為C6H7NO,，并預測同位素離子豐度與實測質(zhì)譜圖比對。最后利用ChemSpider節(jié)點進行化學式檢索,，得到的匹配結(jié)果信息為2-乙?；量@與EI定性結(jié)果一致,。
圖4-5. EI解卷積后的NIST匹配結(jié)果（質(zhì)量偏差-0.49ppm, -0.00005Da）（點擊查看大圖）
圖4-6. PCI解卷積結(jié)果,，自動找到分子離子M+= 109.05269（點擊查看大圖）
圖4-7. PCI自動預測分子式，C6H7NO
（點擊查看大圖）
圖4-8. ChemSpider節(jié)點確認的化合物（質(zhì)量偏差-0.67ppm,，-0.00007Da）,，與EI匹配結(jié)果一致（點擊查看大圖）
EI/CI自由切換，拒絕宕機
EI結(jié)合PCI雙重定性需要切換EI和CI離子源,。賽默飛具有獨特的VPI技術(shù),，可以在不破壞質(zhì)譜真空的情況下2分鐘之內(nèi)切換EI源和CI源，5分鐘內(nèi)更換色譜柱,，消除宕機時間,，輕松實現(xiàn)EI/PCI聯(lián)合定性或雙柱RI定性。
05
植物精油 – GC×GC-Orbitrap
精油具有香氣和抗菌性,，因此作為天然調(diào)味劑和抗菌劑用于食品,。收獲季節(jié)、地理來源,、萃取方式都會影響精油組成,，造成其感官特征和抗菌性能的差異。有必要對精油中痕量化合物進行表征和差異分析,。
我們搭建了GC-Orbitrap/MS與全二維固態(tài)調(diào)制器聯(lián)用平臺，通過全自動的非靶向分析流程,，對共流出化合物進行有效分離定性,，為未知物的分離鑒定提供新的思路和方法。
GC×GC全二維分離
在二維TIC圖中,，可以看到多個一維保留時間完全一致的組分簇（如：RT 43.903min,，RT=50.203min）,。本實驗中使用全二維氣相色譜通過串聯(lián)兩根不同極性的色譜柱，在第二個維度上實現(xiàn)了一維共流出化合物的分離,，一針進樣實現(xiàn)雙柱分離的效果,，很大程度上簡化了從復雜樣品中鑒定未知化合物的流程（圖5-1）。
圖5-1. 通過二維色譜分離,，一維色譜柱上完全共流出的化合物被準確定性（點擊查看大圖）
圖5-2. 精油樣品全二維GC×GC-Orbitrap/MS分析結(jié)果（3D視圖）（點擊查看大圖）
寬動態(tài)范圍內(nèi)準確定性
高分辨質(zhì)譜在未知化合物分析中最大的優(yōu)勢之一,，在于可以通過化合物實測的精確質(zhì)量數(shù)對化合物的結(jié)構(gòu)進行推斷。在TIC圖中選取主要成分乙酸冰片酯和痕量組分丁香酚（比主成分低4個數(shù)量級）,，查看二者的精確質(zhì)量數(shù)測量結(jié)果（圖5-3和5-4）,。結(jié)果顯示，二者的實測離子和同位素離子的質(zhì)量偏差均小于2ppm,。
圖5-3. 精油樣品TIC圖：①主要成分,，RT=36.43，乙酸冰片酯,；②痕量組分,，RT=39.53，丁香酚,。（點擊查看大圖）
圖5-4. GC×GC-Orbitrap/MS實測主成分和痕量組分的質(zhì)量精度（<2ppm）及位素離子豐度比率（通過）（點擊查看大圖）
綜上,，GC×GC-Orbitap/MS在精油樣品定性分析中表現(xiàn)優(yōu)異，通過全自動的解卷積非靶向分析流程,，無論主成分還是痕量成分都可以準確定性,；全二維色譜提升了色譜分離能力，可得到更全面的樣品成分剖析信息,。
圖5-5. Orbitrap Exploris GC 240 儀器圖片
（分辨率高達240K）
小 結(jié)
食品組學分析通常使用先進的數(shù)據(jù)分析方法,，適當?shù)姆治鰞x器也是重要因素。如今食品組學離不開質(zhì)譜法,，對于揮發(fā)性或半揮發(fā)性的化合物,，使用是氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法。賽默飛提供全線氣相色譜質(zhì)譜產(chǎn)品,，包含氣相色譜,、四極桿質(zhì)譜及高分辨靜電場軌道阱質(zhì)譜，并配套定量,、定性,、組學分析軟件，提供完善可靠的分析流程,。
（點擊查看大圖）
參考文獻：
[1].https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461529
[2].https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132611
[3].https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113504
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