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可比性研究
生物類似藥通常指與參考分子（原研藥）高度類似的治療性生物產品1,。世界各地的監(jiān)管機構,，如美國食品藥品監(jiān)督管理局(United States Food and Drug Administration, USFDA), 歐洲藥品管理局（European Medicines Agency, EMA）和中國市場監(jiān)督管理總局（National Medical Products Administration, NMPA）均發(fā)布了指導規(guī)則，要求證實生物類似藥與原研藥之間在藥品安全性/功效性等方面的相似度1,。
隨著高分辨質譜（HRAM MS）逐步成為創(chuàng)新藥和生物類似藥表征*的分析工具，在氨基酸序列確認和化學/翻譯后修飾等鑒定中,，均起到*的作用2,。2015年，Rogers 等2在公開發(fā)表的文獻中提及可將基于肽圖分析的Multi-Attribute Method (MAM) 工作流程用于多重PQA的監(jiān)控與定量,，與此同時還可進行新組分檢測（new peak detection）2,，進而提供更多產品質量相關信息，并提高生產率,。由此,，MAM在質量控制（QC）實驗室中替代傳統(tǒng)分析手段的潛力，引起越來越多生物制藥行業(yè)和監(jiān)管機構越來越多的關注2 3,。2019年,，US FDA的Rogstad等在發(fā)表的文獻中提及可以考慮使用MAM替代一些常規(guī)的QC分析方法4。
圖1 賽默飛HR-MAM工作流程
（點擊查看大圖）
本期我們介紹賽默飛HR-MAM (圖 1)工作流程的新進展：對未經處理/不同強制降解條件下的生物類似藥與利妥昔原研藥進行可比性研究,，對多個選定PQA進行有效的鑒定,、相對定量和監(jiān)控,，以減少分析實驗所花費的時間，并提高生產率,。
多PQA選定
助力原研藥與生物類似藥結構相似性確證：
PQA通常在藥物安全性與有效性方面起到重要作用,，基于肽圖分析表征可以選擇適合的PQA，如：糖基化（glycosylation）,，脫酰胺化（deamidation）,，琥珀酰亞胺化（succinimide formation），異構化（isomerization）,，氧化（oxidation）,，重鏈C-末端賴氨酸截斷（C-terminal lysine truncation），N-末端焦谷氨酸環(huán)化（N-terminal pyroglutamate）,。
所有被選中的PQA可在BioPharma Finder軟件中創(chuàng)建為一個包含該PQA肽段保留時間/質荷比/價態(tài)/所有電荷態(tài)等信息的工作簿,，隨后此工作簿被導入至變色龍軟件中，用于后續(xù)的MAM數(shù)據(jù)分析,。使用HR-MAM工作流程,，即使是含量約0.1%的組分，也可通過高分辨質譜平臺提供的數(shù)據(jù)獲得高重現(xiàn)性的定性與定量結果,。在本文的研究中,，選定了下列PQA來證實HR-MAM工作流程用于目標肽段定量的能力，
進而評估利妥昔原研藥與生物類似藥之間的結構相似性：
重鏈 N55 脫酰胺化和琥珀酰亞胺化;
重鏈 N388和N393 脫酰胺化;
重鏈 N388和N394 琥珀酰亞胺化;
重鏈 M256 氧化;
重鏈 D284 異構化;
重鏈N-糖基化;
重鏈C-末端賴氨酸截斷和輕/重鏈N-末端焦谷氨酸環(huán)化,。
PQA相對定量
兼具穩(wěn)健性與重現(xiàn)性,，MAM展現(xiàn)*潛力：
由于C-末端賴氨酸截斷與N-末端焦谷氨酸環(huán)化等末端修飾會影響單克隆抗體產品的電荷異質性5，所以在結構可比性研究中需要對其進行評估,。以本文中涉及的PQA為例,，利妥昔原研藥和兩個不同批次的生物類似藥，其重鏈C-末端賴氨酸截斷與輕/重鏈N-末端焦谷氨酸環(huán)化的比率均在可比范圍內（圖2）,。值得注意的是,，所有定量結果三針技術重復的變異系數(shù)（coefficients of variation, CVs）均小于2%，顯示了優(yōu)異的重現(xiàn)性,。
圖2. 利妥昔原研藥/生物類似藥在未經強制降解/強制降解條件下常見末端修飾相對定量結果,。圖中每個條柱均代表三針技術重復的平均值，誤差線代表三針技術重復的標準偏差（下同）,。（點擊查看大圖）
N-糖基化可能會影響單克隆抗體產品的免疫原性,、藥效、抗體依賴的細胞介導細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）,、補體依賴的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC）,、血清清除率和藥代動力學5。在生物類似藥的開發(fā)和生產過程中,，為了確保產品的安全性和有效性,，N-糖基化必須被密切監(jiān)控并嚴格控制,。對于生物類似藥開發(fā)廠商而言，生物類似藥的糖基化異質性分布必須與其原研藥具有可比性,，以避免擴大臨床試驗的規(guī)模,。
在本方案涉及的實驗所用的原研藥和生物類似藥樣品中，總共鑒定到15種不同糖型,，這些糖型的相對含量在不同樣品之間并沒有明顯區(qū)別（圖3）,。與傳統(tǒng)N-糖鏈定量方法相比，未發(fā)生糖基化修飾的肽段相對含量也可在HR-MAM工作流程中同時被監(jiān)控,，這是傳統(tǒng)方法無法做到的,，展現(xiàn)了其獨到價值。對所有糖型的相對定量結果同樣顯示了優(yōu)異的重現(xiàn)性和靈敏度,。例如,，對于相對含量約0.3%的糖型A2S1G0F ，其技術重復之間的CV<5.5%,。
圖3. 利妥昔原研藥/生物類似藥在未經強制降解條件下重鏈EEQYNSTYR 15種糖型相對定量結果（三針平行技術重復）,。（點擊查看大圖）
對于其他選定PQA，借助于賽默飛高分辨質譜平臺的高靈敏度和高選擇性,，結合Vanquish UHPLC系統(tǒng)和Accucore Vanquish C18 +色譜柱提供的高重現(xiàn)性分離,，均可實現(xiàn)兼具穩(wěn)健性與重現(xiàn)性兼具的相對定量。
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參考文獻：
[1] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015.
[2] Liu, H., et al. A high-resolution accurate mass multi-attribute method for critical quality attribute monitoring and new peak detection. APPLICATION NOTE 72916.
[3] Rogstad, S., et al. Multi-Attribute Method for Quality Control of Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 2019, 91, 14170−14177.
[4] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015.
[5] Beck, A., et.al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2013, 85, 715−736.
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