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關(guān)鍵詞： 單克隆抗體,，游離糖型，糖肽,，完整蛋白,，Q Exactive Plus超高分辨質(zhì)譜儀，Vanquish Flex Binary超高壓二元液相色譜儀,，熒光檢測(cè)器

前言 重組單克隆抗體（mAbs）已是日益廣泛使用的治療性蛋白質(zhì)藥 物,，其中以IgG1和IgG2類型為常見。其恒定區(qū)的N糖基化在 不同的細(xì)胞系,、克隆和生產(chǎn)條件之間的差異很大,，且具有高度 的異質(zhì)性,，聚糖結(jié)構(gòu)或不同聚糖類型含量的改變通常影響抗體 生物學(xué)活性、穩(wěn)定性,、免疫原性和半衰期,，是許多治療性抗體 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性,，對(duì)控制產(chǎn)品一致性至關(guān)重要[1],。 分析不同寡糖結(jié)構(gòu)和含量的傳統(tǒng)策略為通過PNGase F糖苷內(nèi)切 酶將寡糖從抗體中釋放，對(duì)糖鏈進(jìn)行標(biāo)記,、熒光對(duì)其進(jìn)行定性 和定量,，然而其局限于需要寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，且當(dāng)抗體中含有多個(gè) N糖基化位點(diǎn)時(shí),，不能區(qū)分位點(diǎn)的異質(zhì)性,，而基于高分辨質(zhì)譜 對(duì)寡糖及糖肽的定性和定量則能夠解決上述問題，但定量時(shí)需 考慮不同離子的離子化效率不同,。本文采用LC-MS/MS法對(duì)原 研IgG1抗體藥物的N糖肽及游離寡糖進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量,，同 時(shí)與經(jīng)典方法LC-FLD進(jìn)行定量結(jié)果的比較。

 實(shí)驗(yàn)方法 1.試劑 10 kD超濾管（P/N MRCPRT010,，Merck）,，8 M鹽酸胍 （P/N 24415，Thermo Fisher）,，1 M Tris-HCl pH=8.0（P/N 15568025,，Thermo Fisher），二硫蘇糖醇（P/N D9163- 5G,，Sigma-Aldrich）,碘乙酰胺（P/N I6125-10G,，SigmaAldrich），胰蛋白酶（P/N V5117,，Promega）,，Glycoworks RapiFluor-MS（P/N 176003635，Waters）,，質(zhì)譜級(jí)甲酸（P/N 85178,，Thermo Fisher），質(zhì)譜級(jí)乙腈（P/N 51101,，Thermo Fisher），質(zhì)譜級(jí)水（P/N 51140,，Thermo Fisher）

2.樣品制備 單抗樣品酶解：加入200 μL ddH2O 到10 kD 超濾管中,，11,000 g離心1min，去除超濾管中少量的甘油,。加入100 μg單 抗,，11,000 g離心3 min,。加入200 μL ddH2O 置換一次去除樣 品中的鹽。加入98 μL 8 M鹽酸胍,，加入2 μL 500 mM DTT,， 終濃度10 mM，56℃,，反應(yīng)30 min,。加入2 μL 1 M 碘乙酰胺， 終濃度20 mM,，室溫,，避光，反應(yīng)30 min,。反應(yīng)液11,000 g離 心10 min,。加入200 μL 終濃度為100 mM Tris-HCl（pH=8.0） ，11,000 g離心10 min,，重復(fù)一次,。用100 μL 100 mM Tris-HCl 復(fù)溶，加入2.5 μg Trypsin 37℃孵育4 h,。加入10 μL 10%甲酸酸 化（終濃度約為1%甲酸）,，單抗肽段終濃度約1 μg/μL。 糖鏈的釋放及熒光標(biāo)記：參照Glycoworks RapiFluor-MS試劑盒 說明書,，即使用RapiGest SF和Rapid PNGaseF酶將糖鏈快速 釋放,；將糖鏈釋放混合物與RapiFluor-MS混合，室溫標(biāo)記5min 后,，用乙腈稀釋該反應(yīng)混合物,；利用GycoWorks HILIC μElution 提取板對(duì)已標(biāo)記的糖胺進(jìn)行純化，實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟參照相應(yīng)說明 書,。

 3.液相,、質(zhì)譜設(shè)備及分析方法 質(zhì)譜儀器: Thermo Fisher Q Exactive Plus高分辨質(zhì)譜儀 液相色譜: Thermo Fisher Vanquish Flex Binary超高壓二元液相 色譜儀，包括二元梯度泵（P/N VF-P10-A）,，柱溫箱（P/N VH-C10-A）,，進(jìn)樣器（P/N VF-A10-A-02），基座（VF-S01- A）,，熒光檢測(cè)器（P/N VF-D51-A）,，熒光流通池（P/N 6079.4330） 色譜柱: AccucoreTM C18 2.1×150 mm色譜柱（P/N 27101- 152130，Thermo Fisher）,，ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 1.7μm,，2.1mm×150mm色譜柱（P/N 186004742，Waters ） 數(shù)據(jù)分析軟件: Thermo Fisher BioPharmaFinder3.1，免費(fèi)軟件 GlycoWorkbench 色譜方法: 見表1A,，表1B 質(zhì)譜方法: 見表2A,，表2B 

 4.數(shù)據(jù)分析 使用BioPharma Finder 3.1軟件分別對(duì)LC-MS/MS采集的抗體完整分子量和糖肽進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量，主要分為：第yi步序列編 輯,，使用BPF 3.1自帶的CHO糖型庫,，第二步設(shè)置具體解析參數(shù)，第三步查看結(jié)果,，肽圖分析具體參數(shù)設(shè)置如圖1A所示,；完整蛋 白分子量測(cè)定具體參數(shù)設(shè)置如圖1B所示。根據(jù)BPF 3.1軟件中182種糖型,，對(duì)LC-MS/MS采集的游離糖型進(jìn)行一級(jí)分子量的提 取,，并使用GlycoWorkbench軟件對(duì)提取到的糖型進(jìn)行二級(jí)碎片離子的確證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.基于LC-MS/MS方法對(duì)游離糖型,、糖肽和完整蛋白水平糖型 鑒定結(jié)果的分析 在沒有游離糖標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),，利用Orbitrap高分辨質(zhì)譜一級(jí)分子量和豐富的糖碎片離子能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)未知糖型的鑒定，同時(shí)與 糖肽鑒定結(jié)果進(jìn)行相互的驗(yàn)證,。本次實(shí)驗(yàn)利用軟件GlycoWorkbench對(duì)糖型結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,，如圖2所示以A2G0F糖型為例的碎 片離子匹配圖，本次實(shí)驗(yàn)中共鑒定到16種游離糖型,。

 此外,，基于Orbitrap高靈敏度、HCD產(chǎn)生的豐富碎片離子及BioPharmaFinder軟件含有的182種CHO N糖型庫,，在本次實(shí)驗(yàn)中 共鑒定并相對(duì)定量到20種不同的N糖肽,，其一級(jí)質(zhì)量偏差均小 于5ppm，且含有較為豐富的碎片離子,，如Y1,，Y1-F及糖的碎 片離子，以豐度低的N糖肽M8（相對(duì)含量為0.07%）為例,， 其一級(jí)質(zhì)量偏差為1.8ppm,，二級(jí)仍具有豐富的碎片離子，如圖 3所示,，得以充分確證并準(zhǔn)確定量各種低含量的翻譯后修飾,。

 完整蛋白水平糖型的鑒定無需樣品前處理，是為直接的方 法,，但由于完整蛋白分子量大,、異質(zhì)性高且在色譜上難分離， 對(duì)質(zhì)譜的檢測(cè)要求更高,，如圖4所示本次實(shí)驗(yàn)中共鑒定并相對(duì)定 量到6種高豐度的不同糖型,。

2.比較LC-MS/MS和熒光法對(duì)游離糖型,、糖肽和完整蛋白水平 的定量結(jié)果 表3中熒光和質(zhì)譜法對(duì)游離糖型的定量及糖肽水平定量結(jié)果顯 示，兩者對(duì)含量高于1%的糖型定量結(jié)果趨勢(shì)一致,，可以說明高 含量的這幾種糖型在質(zhì)譜源區(qū)的離子化效率對(duì)定量結(jié)果影響不 大，對(duì)于低豐度糖型定量趨勢(shì)出現(xiàn)差異,，可能由樣品前處理或 質(zhì)譜離子化效率導(dǎo)致,，需進(jìn)一步驗(yàn)證。完整蛋白水平對(duì)高含量 糖型的定量與糖肽和游離糖型的結(jié)果趨于一致,，可用于日?？?速監(jiān)測(cè)高豐度糖型的變化。 

總結(jié)和討論 在完整蛋白分子量測(cè)定和糖肽水平均可使用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行糖 型分析,，高分辨質(zhì)譜和經(jīng)典的液相色譜法同樣能夠?qū)τ坞x糖鏈 進(jìn)行糖型的鑒定和定量,，即目前有4種分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)糖 型的分析?；谕暾鞍姿降奶切头治?，前處理簡(jiǎn)單、質(zhì)譜 分析時(shí)間短,，是為簡(jiǎn)單的方法,，但對(duì)糖型種類多、異質(zhì)性高 的抗體而言,，不同成分在質(zhì)譜離子源區(qū)域的離子化程度可能會(huì) 不同,，導(dǎo)致低豐度糖型會(huì)鑒定不到，但可用于監(jiān)測(cè)高豐度糖型 的變化,；基于高分辨質(zhì)譜的糖肽水平糖型分析,，需經(jīng)過抗體酶 解，LC-MS分析時(shí)間較長,，糖肽上糖型的準(zhǔn)確鑒定依賴于高分 辨質(zhì)譜的靈敏度,、碎片離子的豐富度及糖型數(shù)據(jù)庫的大小，相 對(duì)定量時(shí)需考察不同糖型的離子化效率,，如滿足以上條件,，此 方法作為糖型監(jiān)測(cè)為高效和靈敏的方法，同時(shí)能夠準(zhǔn)確鑒定 糖基化位點(diǎn),，當(dāng)對(duì)含有2種或2種以上不同糖基化位點(diǎn)的蛋白類 藥物糖型監(jiān)測(cè)時(shí)優(yōu)勢(shì)更為明顯,；基于高分辨質(zhì)譜對(duì)游離糖型的 定性和定量方法，為提高質(zhì)譜響應(yīng)需進(jìn)行糖型的標(biāo)記,，此標(biāo)記 過程復(fù)雜或試劑昂貴,，以及是否會(huì)影響某類糖型的鑒定和定量以及不同糖型在質(zhì)譜離子源區(qū)的離子化效率仍需考察，但靈敏 度明顯高于液相色譜法,；基于液相色譜法對(duì)游離糖型的定性和 定量,，前處理同樣稍復(fù)雜，但無需考察離子化效率問題，依賴 于標(biāo)準(zhǔn)品和保留時(shí)間,，靈敏度稍差,，適用于大規(guī)模監(jiān)測(cè)生產(chǎn)中 的主要糖型。本文中建立的4種方法都可以地對(duì)單抗的糖型 進(jìn)行表征,，基于質(zhì)譜的表征方法較色譜法有很大的優(yōu)勢(shì),，具有 靈敏度高、樣品處理簡(jiǎn)單以及獲得糖型信息更加完整的優(yōu)勢(shì),， 有望用于單抗大規(guī)模生產(chǎn)中糖型的監(jiān)測(cè),。

參考文獻(xiàn) [1] Wang T, Chu L, Li W, et al. Application of a quantitative LC–MS multiattribute method for monitoring site-specific glycan heterogeneity on a monoclonal antibody containing two N-linked glycosylation sites[J]. Analytical chemistry, 2017, 89(6): 3562- 3567.