生物制藥微課堂|第三期-單克隆抗體藥物的電荷變異體表征
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生物制藥微課堂
單克隆抗體是復(fù)雜的糖蛋白,，通常呈現(xiàn)微觀不均一性,，包括各種修飾形成的變異體。這些變異體可能來自復(fù)雜的細胞培養(yǎng)工藝,、純化及制劑等制造過程或儲存過程的任何階段,。由于抗體所帶電荷差異造成的異質(zhì)性稱為電荷變異體，這些變異體可能會影響抗體的穩(wěn)定性,，藥效,，免疫原性等，因此對電荷變異體的表征和質(zhì)控至關(guān)重要,。通過對變異體的分子量及肽圖的表征,，可以確定其修飾種類及后續(xù)QC中的質(zhì)量監(jiān)控。
本期微課堂為您帶來：
單克隆抗體藥物電荷變異體分析解決方案
賽默飛提供兩種方案,，讓您的分析選擇更靈活,，輕松應(yīng)對！
方案1：在線CEX-MS方案
本期微課堂來自NIBRT的Jonathan Bones報告，介紹了如何使用在線CEX-MS的分析方法快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾,。
Advances in Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using pH Gradient Cation Exchange Chromatography hyphenated to Mass Spectrometry
要點1：
電荷變異體分析常用的PH梯度或鹽梯度方法,，其流動相一般含不揮發(fā)性鹽，需要色譜分離后再接餾分,，除鹽凍干再進質(zhì)譜分析,，這一復(fù)雜過程容易造成樣品損失及蛋白變性。因此在線CEX-MS的分析方法能夠很好的解決這一問題,，通過使用低離子強度,、揮發(fā)性鹽的流動體系，在PH梯度條件下分離電荷變異體,，同時進質(zhì)譜分析,，能夠快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾，包括C端賴氨酸變異體,、脫酰胺,、焦谷氨酸環(huán)化、糖化以及抗體相關(guān)片段等,。
CVA-MS on Q Exactive Plus MS
要點2：
對于在線CEX-MS分析,，怎樣在保證完美的色譜分離度情況下，準確檢測每個色譜峰對應(yīng)的修飾種類,？此次報告會詳細介紹流動相的選擇,、PH條件優(yōu)化及阿達木單抗、西妥昔單抗的具體案例分析,，以及如何根據(jù)所得數(shù)據(jù)分析電荷變異體的來源,，例如由于宿主細胞殘留蛋白的存在而造成單抗降解為不同的片段等。
CEX-MS analysis of Adalimumab
要點3：
Zipchip-MS微流控毛細管電泳質(zhì)譜作為CEX-MS的互補技術(shù),，在電荷變異體分析中有很好的性能,，可在更短的分析時間，使用少量樣品,，得到完整的電荷變異體數(shù)據(jù),。對于酸性蛋白質(zhì),，可使用AEX-MS分析,，能夠在低PH梯度下觀測到更多蛋白異構(gòu)體，如唾液酸化,、巖藻糖基化修飾及降解片段等,。該部分內(nèi)容作為CEX-MS的互補技術(shù)，會以實際案例來說明如何從全方面表征抗體電荷變異體,。
AEX-MS analysis of Ovalbumin
方案2：離線CEX-MS分析方案：
賽默飛離線CEX-MS方案,，包括超高效液相Vanquish，餾分收集器，及超高分辨質(zhì)譜Orbitrap,，可以從完整蛋白,、亞基及肽圖三個層面對離子交換酸堿峰進行深度表征分析。相比在線CEX-MS方案,，該方法可以使用非揮發(fā)性鹽,，使CEX的方法優(yōu)化更簡便，但需要增加凍干除鹽等步驟,，可根據(jù)不同需求選擇合適方案,。
完整分子量分析：
如下圖1所示，收集CEX分離所得餾分,，經(jīng)過除鹽凍干處理,，LC-MS檢測，可在完整分子量層面觀測到各個餾分的糖型分布情況,，大部分糖基化修飾形成酸性峰,，C端賴氨酸丟失及酰胺化等修飾形成堿性峰[1]。
圖1：CEX餾分完整分子量分析
輕重鏈分析：
輕重鏈分析可進一步在分子量層面觀測到更多的信息,，如加速穩(wěn)定性實驗中,，不同的溫度及PH條件下，蛋白藥物會發(fā)生氧化及降解等反應(yīng),。將CEX分離的餾分經(jīng)過DTT還原等處理,，通過orbitrap檢測，在超高分辨的性能下可測得輕鏈單同位素分子量,，并觀測到微小變化的修飾峰,，下圖所示為CEX的某個餾分經(jīng)DTT還原后的質(zhì)譜分析結(jié)果，測得輕重鏈及氧化,、脫水,、糖化等雜質(zhì)峰[2]。
肽圖分析：
肽圖分析能夠精確定位翻譯后修飾位點及發(fā)現(xiàn)更低豐度的修飾,，如下圖所示,，通過對三個酸性峰AF1-AF3及堿性峰BF1、BF2餾分進行肽圖分析,，可確定每個餾分包含的修飾種類及相對含量,，相對含量僅為0.01%的修飾也能被準確鑒定，其中紅色標注為主要修飾,。Orbitrap的超高靈敏度和分辨率能夠檢測到更多含量的PTMs及序列變異體,，尤其對于餾分收集樣品，更需要高靈敏度檢測方法,。
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單克隆抗體藥物電荷變異體分析相關(guān)解決方案
參考文獻：
1. François G, Blandine D, et al. Unbiased in-depth characterization of CEX fractions from a stressed monoclonal antibody by mass spectrometry. mAbs, 2017.
2. Deyun W, Colin W, et al. Characterization of Drug Product-related Impurities and Variants of a Therapeutic Monoclonal Antibody by Higher-energy C-trap Dissociation Mass Spectrometry. Anal. Chem.,2014.
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