制備色譜技術(shù)與操作；半制備HPLC：儀器管路粗,，進(jìn)樣體積大（可達(dá)1m,；制備色譜柱和填料：玻璃柱和不銹鋼柱，填料可為硅膠,；親水樣品選擇正相固定相,；大分子選擇離子交換色譜固定相；碳水化合物選擇疏水色譜固定相,；無機(jī)離子選離子色譜固定相,；合成聚合物選凝膠色譜固定相；立體異構(gòu)樣品選環(huán)糊精固定相,；外消旋樣品選手性固定相,；樣品前處理：萃取、過濾,、結(jié)晶,、固相萃取,；裝柱方法：
制備色譜技術(shù)與操作

半制備HPLC：儀器管路粗,，進(jìn)樣體積大（可達(dá)1mL以上），進(jìn)樣量大（一般可達(dá)到幾十毫克）,，檢測池大,，泵耐壓大，流速高（可達(dá)10mL/min甚至更高）,，柱子內(nèi)徑3cm~100cm,，含餾分收集器，可以制備樣品進(jìn)行其它定性檢測,，或接分析柱也可進(jìn)行HPLC分析,。

制備色譜柱和填料 ：玻璃柱和不銹鋼柱，填料可為硅膠、鍵合固定相（如C18）,、離子交換樹脂 ,、聚酰胺、 氧化鋁,、 凝膠,，對硅膠進(jìn)行硝酸銀（或緩沖液）處理可提高分離效果。疏水樣品選擇反相固定相

親水樣品選擇正相固定相

大分子選擇離子交換色譜固定相

碳水化合物選擇疏水色譜固定相

無機(jī)離子選離子色譜固定相

合成聚合物選凝膠色譜固定相

立體異構(gòu)樣品選環(huán)糊精固定相

外消旋樣品選手性固定相

樣品前處理：萃取,、過濾,、結(jié)晶、固相萃取,。

裝柱方法：顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填,，使相對稀松的固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成,。柱直徑大于20mm,，所加壓力為30－40bar時(shí)，采用柱長壓縮技術(shù),，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓,，利用物理方法將其壓緊，如徑向壓縮和軸向壓縮,。

流動(dòng)相：色譜分離后要旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑,，不宜采用高毒性溶劑，少用多元溶劑,，溶劑的純度也要考慮。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱,，酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁,、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)，離子交換樹脂＆排阻色譜遇到某些有機(jī)溶劑會(huì)膨脹或收縮,，從而改變柱床的性質(zhì),。流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象,。 流動(dòng)相選擇方法（1）由強(qiáng)到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn),， 這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例,。（2）三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量,，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則,。

（3）粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度,，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率,，直至各組分的分離情況不再改變,。

加樣： 可采用注射器進(jìn)樣,、旋轉(zhuǎn)閥進(jìn)樣、六通閥進(jìn)樣,、主泵進(jìn)樣,、輔泵進(jìn)樣或固體上樣。 檢測器： 一般的分析池的zui大允許流速僅為5 mL/min 或者10mL/min,。而專門的制備池的

zui大允許流速可為150mL/min,。有時(shí)，采用旁路分離管,，將少量流體導(dǎo)入分析池進(jìn)行檢測,，是一個(gè)不錯(cuò)的辦法，但其濃度的誤差會(huì)相對較大,。

1 問: 我想購買waters600用于分析和制備,，對于其配備有什么好的建議。

可以配一個(gè)PDA,，另外加一個(gè)示差折光410,，另外買幾根制備柱就可以了。waters600的流速zui大為20mL/min,，一般可以配20mm ID的制備柱,，一次分離10-100mg的樣品，如果樣品量更大,，可以通過配件擴(kuò)展到45mL/min,，使用30mm ID的制備柱。另外為了保證餾分收集的準(zhǔn)確性,，配上Fraction II 餾分收集器,。如果樣品數(shù)量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同時(shí)做自動(dòng)進(jìn)樣并通過MS或U號自動(dòng)收集餾分,。zui大通量每天可以處理100-200個(gè)樣品,。

2 問： 如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器,，色譜儀為Agilent 1100或LC-6A,。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析,。如何設(shè)定色譜條件,，如流量，進(jìn)樣量,，樣品的濃度,，切割點(diǎn)的設(shè)置，是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除,。（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近,。）

(1)制備用的流動(dòng)相等級高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析,。

(2)使用餾分收集器時(shí),，延遲體積一定要計(jì)算，檢測器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到zui小,，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率,。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min,，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2, 大約為4ml/min,。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好,。假如進(jìn)樣10mg,，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5ug，顯然濃度太低,，是多做幾次,，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

3 問：我想用hplc分離一個(gè)簡單的多肽,我應(yīng)該選用什么樣的流動(dòng)相,梯度和柱子?

RP-HPLC的C18柱可以制備很少量的肽,，如果用RP-HPLC,，首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì)，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品,，根據(jù)峰形逐漸放大純化的方法,。 4 問：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害,，那是不是說它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢,？

（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.05-0.1%,，過高的濃度，會(huì)使溶液偏酸,，長

時(shí)間使用可能影響柱子壽命,。（2）同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型,。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話,。可以考慮加大濃度到0.2%,。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱,。（3）走梯度時(shí)，因?yàn)樽叱苫€漂移，但對制備的影響不大,。

5 問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC,？

（1） 了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等, 以達(dá)到較好的溶解度,。（2）樣品可能某種晶型難溶,，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶。

（3）不是一定要用流動(dòng)相來溶解樣品,，對溶解度差的樣品,，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品,。特別是DMSO,，對一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留,，不會(huì)造成干擾,。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會(huì)影響峰型,。（4） 可以固體上樣,。 6 問：多肽的分離制備, 如何上量？如何增大分離度?

反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法,，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動(dòng)相,，看保留如何，若無保留,，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離,。

關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小,，然后選擇不同類型的填料,，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6MM內(nèi)徑）上做一下實(shí)驗(yàn),找到zui大的分離度,這一過程的難度是zui大的,要不斷地改變流動(dòng)相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。分離后可以通過冷凍干燥得到固體,。

還可以考慮離子交換來分離多肽。

7 問： 做柱層析時(shí)（國產(chǎn)大孔吸附樹脂）,，怎么才能把洗脫液中的樹脂殘留物處理干凈,？ 大孔吸附樹脂在上使用前，一般需要進(jìn)行處理,，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到?jīng)]有吸收,；或樹脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天,，然后用常規(guī)的酸,，堿洗,。再用丙酮回流二小時(shí)就可以用了。

8 問：由分析型液相轉(zhuǎn)為制備型液相,，其色譜系統(tǒng)需作多大調(diào)整,？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜,？

（1）泵要換,，流量要加大，壓力可不變或減少,；流通池要換體積更大的,。

（2）整個(gè)系統(tǒng)的管路要更換更粗的，否則壓力太大,而且特別容易發(fā)生堵塞,。對流通池后的管路,，增加反壓調(diào)節(jié)器，否則管路太短的話,，反壓小會(huì)導(dǎo)致流通池氣泡,，管路長的話會(huì)導(dǎo)致峰展寬。

（3）檢測器的響應(yīng)時(shí)間和峰寬要設(shè)置合適,，否則會(huì)導(dǎo)致收集時(shí)延遲體積的計(jì)算不準(zhǔn),。

（4）上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度,、制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）,；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長度成正比。

9 問：流動(dòng)相中含有鹽時(shí),，收集液該如何除鹽,？選用揮發(fā)性酸，堿或鹽（如醋酸銨）是否會(huì)在揮干溶劑或凍干過程中直接除去,？

一般可以采用離子吸附的辦法去掉（可以參考離子吸附有關(guān)技術(shù)）,。但也是稍微麻煩的事情，,，不加酸堿鹽,，如果要加的話，要加揮發(fā)性的或者對產(chǎn)品或者檢測沒有干擾的,。 可用G25脫鹽,，它是安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠。交聯(lián)度大孔徑小,對小分子的無機(jī)鹽保留較大,而對分子量較大的有機(jī)物沒有保留從而可以將鹽份脫除,。另外采用揮發(fā)性的酸，堿時(shí),，一般會(huì)在干燥過程中直接除去,，但如果樣品也有酸堿性,，可能會(huì)與這些揮發(fā)性酸堿形成一定比例的鹽。

10 問：制備型柱子柱壓上升,、柱效下降怎么辦,？

堵塞柱子的原因：

（1） 如果您所分離的樣品中雜質(zhì)較多而您在上樣前沒有經(jīng)過過濾（0.45微米），一些顆粒性雜質(zhì)會(huì)積聚在柱頭造成柱壓升高,，

（2） 也有可能是因?yàn)槟褂玫牧鲃?dòng)向中含有緩沖鹽的原因,，結(jié)晶或發(fā)生化學(xué)變化而堵塞?？梢园阎記_一沖,。

（3）流動(dòng)相是否符合液相色譜的要求？是否過濾處理,？

柱子再生辦法：

（1）依次用水,，甲醇，四氫呋喃,，甲醇來沖洗柱子,，每種溶劑5-10個(gè)柱體積。（2）如果效果不明顯,，將柱子按以上順序反沖,，但一般將大大降低柱子效果。

（3）如果效果還是不好,，就需要打開色譜柱,，超聲波清洗篩片。必要時(shí)挖掉色譜柱內(nèi)受污染部位,，填入新的填料,，還可用3個(gè)月。（填的時(shí)候小心,，別重新污染柱子）

11 問：制備柱柱跑干了影響柱效嗎?

如果時(shí)間不長的話,可以用流動(dòng)相多沖幾個(gè)小時(shí).柱效不一定變化很大.如果時(shí)間太久,柱效一定變低. 具體造成影響有多大,，要靠柱效測定來確定，而不是干柱時(shí)間的長短,。如果跑干了,，對于PUMP的影響可能還大些，所以先把管路中的空氣抽走,。

12 問：制備純化蛋白,、多肽，耗用流動(dòng)相驚人,，請問這些用過的流動(dòng)相可以重蒸使用嗎,？

流動(dòng)相用一般減壓方法重蒸后，往往會(huì)形成有機(jī)溶劑和水會(huì)共沸,，另外,，由于減壓蒸餾屬于單次平衡,，往往得不到100%純度的溶劑，這會(huì)使溶劑的配置有一定困難,，從而使色譜的重現(xiàn)性和分離度會(huì)發(fā)生一定的變化,。如果要求不是很高的話，一般可以分析重蒸后餾分中的各組分含量,，計(jì)算后再使用,。

要通過重蒸得到純物質(zhì)是極其困難的，必須采用精餾塔多級蒸發(fā),，單就設(shè)備投資和能耗來講,，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模或生產(chǎn)規(guī)模的廢液回收處理已經(jīng)是得不償失,。其實(shí),，我們沒有必要得到純的物質(zhì)。

13 問：反相色譜分離純化后,，怎樣除去流動(dòng)相產(chǎn)品中的TFA和乙腈或其他雜質(zhì),？

TFA是反相色譜分離中常用的添加劑，可以用凍干的辦法去除,，還可以試試離子交換,、凝膠層析、甚至透析和超濾,，其中,，離子交換層析效果比較好，還可以起到濃縮樣品的作用,。 首先,，凍干的辦法應(yīng)該可以幾乎*地除去TFA和乙腈，藥物實(shí)驗(yàn)前先檢測一下凍干品中的殘留量,，只要不超過允許范圍,，這種辦法是zui簡單有效的。

其次,，如果你的藥物的分裝量不大的話(<100ug),，建議你用離子交換層析，裝一個(gè)小一點(diǎn)兒的柱子,，讓含鹽洗脫峰的蛋白濃度達(dá)10mg/ml以上,，稀釋后*符合試驗(yàn)要求。如果用分子篩,，考慮稀釋,，也先過一個(gè)離子交換。此外可以試試疏水層析,。如果產(chǎn)品是堿的話,，可能會(huì)形成TFA鹽,，這樣通過上述方法就無法除去。一般可以用堿水洗,，然后將產(chǎn)品萃取出來?；蛘咴诶锩婕尤胍欢康柠}酸,，再干燥后形成鹽酸鹽。

14 問：同一種填料的分析柱,、制備柱按線形放大公式套,，分離度會(huì)不會(huì)變化？ 一般會(huì)有一定的變化,，原因有以下幾點(diǎn)

（1）制備柱的裝填是否均勻,，如不均勻則可能產(chǎn)生渦流擴(kuò)散使各個(gè)組分的經(jīng)過通道的直徑不同、阻力不一樣,，停留時(shí)間不同,，色譜峰可能變寬。

（2）如果樣品在流動(dòng)相中溶解度小,，在制備色譜上會(huì)有不同的峰展寬,。

（3）如果樣品在分析柱上有展寬或拖尾的現(xiàn)象，放大到制備柱上后峰的展寬和拖尾經(jīng)常會(huì)非常嚴(yán)重,，導(dǎo)致分離失敗,。

15 問：反相色譜分離后，如何快速從流動(dòng)相中得到產(chǎn)品,？

可以考慮先在低溫下,，減壓旋蒸除去其中的有機(jī)溶劑，然后用萃取的方法把產(chǎn)品萃取出來,，然后再低溫再旋蒸,，這樣，就可以不將溫度升得很高而得到產(chǎn)品,。 如果要直接蒸掉流動(dòng)相,，水泵的真空度要注意（要檢查氣密性），否則蒸水會(huì)很慢,。一般比較好的泵在60-70度即可蒸掉水,，如果泵的真空度不好，可能需要80-90度才行,，這樣容易暴沸導(dǎo)致樣品損失,。另為，溫度太高可能引起物質(zhì)變性,。