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液相色譜儀的五大組成系統(tǒng)介紹
1.進(jìn)樣系統(tǒng) 一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,,進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的,。
2.輸液系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括高壓泵,、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47~4.4X107Pa,,流速可調(diào)且穩(wěn)定,,當(dāng)高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),,可加快其在柱中的移動速度,,這對提高分辨率、回收樣品,、保持樣品的生物活性等都是有利的,。流動相貯存錯和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,包括改變洗脫液的極性,、離子強(qiáng)度,、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等,。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離,。
3.分離系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等,。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時,,可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2~5mm,,由"**不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,,住內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去),、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點,,加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基,、季胺基,、羥甲基、苯基,、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物,。因此,這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性,。例如,,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來,。
另外,,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻,、致密狀態(tài),,極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?;|(zhì)粒度小,,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短,。這些對縮小譜帶寬度,、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析,,基質(zhì)粒度小,,塔板理論數(shù)N就越大,。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小,會提高分辨率的道理,。 再者,,液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,,通過改善傳質(zhì)速度,,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率,。
4.檢測系統(tǒng) 液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器,、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
(1)紫外檢測器 該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測,。其特點:使用面廣(如蛋白質(zhì),、核酸、氨基酸,、核苷酸,、多肽、激素等均可使用),;靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml),;線性范圍寬;對溫度和流速變化不敏感,;可檢測梯度溶液洗脫的樣品,。
(2)示差折光檢測器 凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測,。目前,,糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng),、操作簡單,,但靈敏度低(檢測下限為10-7g/ml),流動相的變化會引起折光率的變化,,因此,,它既不適用于痕量分析,也不適用于梯度洗脫樣品的檢測,。
(3)熒光檢測器 凡具有熒光的物質(zhì),,在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比,。因此,,這一檢測器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸,、胺類,、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測定,,其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用,。
5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集,、貯存、顯示,、打印和處理等操作,,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展,。